Name: a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples at JoVE.com

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> وأيد هذا العمل من قبل وتقنيات البروتين السريرية لمبادرة السرطان ، 5U24CA126477 - 04. </p>

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> <em style='font-style: italic'>Mol Cell Proteomics</em>. <b>6</b>, 2212-2229 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة لتحديد وعزل glycopeptides بطريقة غليكان محددة. كما يختلف ارتباط بالغليكوزيل نطاق واسع داخل كائن حي ، لا سيما خلال تطوير والمرضية ، قد تكون قابلة للتطبيق هذه التقنية لمعالجة طائفة واسعة من الأسئلة. على وجه الخصوص ، نحن نستخدم أسلوب انتقائي لتخصيب glycopeptides التي تم تعديلها مع السرطان المرتبطة الحواتم كخطوة أولى نحو اكتشاف العلامات البيولوجية. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Aleuria aurantia</em> lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Sambucus nigra</em> agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

<p class="jove_content">Glycans هي فئة هامة في مرحلة ما بعد متعدية التعديلات. العثور على عادة تفرز خارج الخلية والجزيئات ، وهياكل غليكان إشارة إلى الحالة الداخلية للخلية. Glycans على الخلايا السرطانية تميل إلى أن تكون وفيرة والحامض اللعابي فوكوز الأنصاف. نقترح أن يتم استغلال هذه المتغيرات المرتبطة بالسرطان غليكان العلامات البيولوجية للتنمية تهدف إلى تشخيص المرض في مرحلة مبكرة. تبعا لذلك ، قمنا بتطوير الطيف الكتلي على أساس سير العمل الذي يتضمن اللوني على المصفوفات تقارب تشكلت من lectins ، والبروتينات التي تربط غليكان هياكل محددة. اقترنت تساهمي في lectins خمان ؛ بلسان أسود (SNA) وبرتقالية Aleuria (العال) ، والتي تربط الحامض اللعابي وفوكوز ، على التوالي ، إلى حبات بوروس (النظم البيولوجية التطبيقية) ، ومعبأة في أعمدة PEEK لارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC). باختصار ، كان المنضب البلازما من البروتينات fourteen الأكثر وفرة باستخدام نظام إزالة تقارب متعددة (MARS - 14 ؛ اجيلنت). وفي الوقت نفسه تقلصت البلازما التربسين - هضمها والمنفصلين في التدفق من خلال والكسور ملزمة SNA أو HPLC AAL. تم علاج الكسور مع PNGaseF لإزالة N - مرتبطة glycans ، وتحليلها بواسطة LC-MS/MS على النخبة QStar. وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج التميمة. تضمنت الضوابط الإيجابية التصميم التجريبي ، وfucosylated sialylated glycopeptides الإنسان واكتوفيرين السلبية تسيطر عالية من glycopeptides مانوز السكيراء البيرة ، التي كانت تستخدم لمراقبة النوعية من التقاط lectin. الميزات الرئيسية لهذا العمل تشمل استنساخ مستمدة من تنسيق HPLC ، وتحديد الإيجابية للأسر وglycopeptides PNGaseF المعاملة من الزخارف الخاصة Asn-Xxx-Ser/Thr deamidated ، وتقييم الجودة باستخدام معايير بروتين سكري. كما تضمن البروتوكول التحسين تحديد نسبة المواد المناسبة للبدء في قدرة العمود ، وتحديد التقاط الأكثر كفاءة ومخازن شطف ، ورصد PNGaseF المعاملة لضمان deglycosylation الكامل. التوجهات المستقبلية تشمل استخدام سير العمل لتنفيذ هذه التجارب اكتشاف مطياف الكتلة المستندة على البلازما من مرضى سرطان الثدي والأفراد السيطرة.</p>

Watch this Scientific Journal Video about A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples at JoVE.com

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

<p class="jove_content">كانوا يعملون Lectin - مترافق الخرز بوروس عن HPLC. خدم معايير ببتيد سكري والضوابط الإيجابية والسلبية. MARS - 14 المستنفد ، كان chromatographed تربسين هضم البلازما البشرية والتدفق من خلال (FT) ، والكسور التي جمعت ملزمة لتحاليل ESI-LC-MS/MS. وقد أثرى Glycopeptides في جزء ملزمة مقارنة FT.</p>

وهناك طريقة HPLC Lectin لإثراء هضميدات انتقائية الغليكوزيلاتي من العينات البيولوجية المعقدة

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Research

JoVE Journal

Biology

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through <em>E. coli</em>

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

المنطق، خطوات التجريبية، وإمكانية البناء الحيوي المنتج من غيري الطبيعية وتتميز هذه الاريثروميسين مجمع المضادات الحيوية المنتجة من خلال A<em&gt; E. القولونية</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

A Method for Microinjection of <em>Patiria minata</em> Zygotes

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

منهج في Microinjection من<em&gt; Patiria minata</em&gt; بيضات ملقحة

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

إزالة المواد من مصادر خارجية من الجزء الخارجي من النوى المجمدة للتحقيق في المجتمعات القديمة البيولوجية آوى داخل

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Method for Labeling Transcripts in Individual <em>Escherichia coli</em> Cells for Single-molecule Fluorescence <em>In Situ</em> Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية <em>الإشريكيّة القولونية</em> للأسفار جزيء واحد <em>في الموقع</em> تجارب التهجين

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Quasi-metagenomic Analysis of <em>Salmonella</em> from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

تحليل شبه الجينومية <em>السالمونيلا</em> من غذاء والعينات البيئية

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...