Name: a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples at JoVE.com

<p class="jove_content"> इस काम के कैंसर पहल, 5U24CA126477-04 के लिए नैदानिक ​​प्रोटिओमिक टेक्नोलॉजीज द्वारा समर्थित किया गया. </p>

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> <em style='font-style: italic'>Mol Cell Proteomics</em>. <b>6</b>, 2212-2229 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content"> इस प्रोटोकॉल glycan विशिष्ट तरीके में glycopeptides अलग और पहचान के लिए एक त्वरित तरीका प्रदान करता है. के रूप में ग्लाइकोसिलेशन विकास और रोगजनन के दौरान विशेष रूप से एक जीव के भीतर बड़े पैमाने पर बदलता है, इस तकनीक को सवालों की एक विस्तृत विविधता का पता करने के लिए लागू हो सकता है. विशेष रूप में, हम विधि का उपयोग कर रहे हैं करने के लिए चुनिंदा glycopeptides कि biomarker खोज की दिशा में एक पहला कदम के रूप में कैंसर से जुड़े epitopes के साथ संशोधित किया गया है समृद्ध. </p>

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Aleuria aurantia</em> lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Sambucus nigra</em> agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

<p class="jove_content">Glycans बाद translational संशोधनों के एक महत्वपूर्ण वर्ग हैं. आमतौर पर secreted और कोशिकी अणुओं पर पाया, glycan संरचनाओं कक्ष की आंतरिक स्थिति का संकेत है. Glycans ट्यूमर कोशिकाओं पर प्रचुर मात्रा में सियालिक एसिड और fucose moieties करते हैं. हम प्रस्ताव है कि इन कैंसर से जुड़े glycan वेरिएंट biomarker विकास के लिए प्रारंभिक अवस्था रोग के निदान करने के उद्देश्य से शोषण किया. तदनुसार, हम एक जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित वर्कफ़्लो कि आत्मीयता lectins, प्रोटीन है कि विशिष्ट glycan संरचनाओं बाँध से गठित matrices पर क्रोमैटोग्राफी शामिल विकसित की है. lectins Sambucus nigra (SNA) और Aleuria aurantia (AAL), जो सियालिक एसिड और fucose बाँध, क्रमशः covalently POROS मोती (एप्लाइड Biosystems) युग्मित कर रहे थे और उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) के लिए तिरछी नज़र स्तंभों में पैक. संक्षेप में, प्लाज्मा चौदह सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की एक बहु आत्मीयता हटाने प्रणाली (Agilent, मार्स-14) का उपयोग समाप्त किया गया था. समाप्त प्लाज्मा trypsin पचा और प्रवाह के माध्यम से और SNA या AAL HPLC से बंधे भिन्न में विभाजित था. भिन्न PNGaseF के साथ इलाज किया गया एन जुड़े glycans हटायें, और एक QStar अभिजात वर्ग पर LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण. शुभंकर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा विश्लेषण किया गया. प्रयोगात्मक डिजाइन सकारात्मक शामिल नियंत्रण - fucosylated और sialylated मानव लैक्टोफेरिन glycopeptides और Saccharomyces से नकारात्मक नियंत्रण उच्च mannose glycopeptides cerevisiae कि लेक्टिन कब्जा की विशिष्टता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया गया. इस वर्कफ़्लो के मुख्य विशेषताएं HPLC स्वरूप, उनके deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr रूपांकनों से कब्जा कर लिया और PNGaseF इलाज glycopeptides की सकारात्मक पहचान, और गुणवत्ता मूल्यांकन ग्लाइकोप्रोटीन मानकों का उपयोग कर से व्युत्पन्न reproducibility शामिल हैं. प्रोटोकॉल अनुकूलन भी स्तंभ क्षमता सामग्री शुरू, सबसे कुशल कब्जा और elution buffers की पहचान और PNGaseF उपचार की निगरानी के लिए पूरा deglycosylation सुनिश्चित करने के उचित अनुपात का निर्धारण भी शामिल है. भविष्य दिशाओं इस वर्कफ़्लो का उपयोग करने के लिए स्तन कैंसर के रोगियों और नियंत्रण व्यक्तियों से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित खोज प्रयोगों प्रदर्शन शामिल हैं.</p>

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A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

<p class="jove_content">Lectin संयुग्मित POROS मोती HPLC के लिए कार्यरत थे. Glycopeptide मानकों को सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की. समाप्त मार्स-14, trypsin पचा मानव प्लाज्मा chromatographed था और प्रवाह के माध्यम से (एफटी) और बाध्य भिन्न ESI-LC-MS/MS विश्लेषण के लिए एकत्र. Glycopeptides बाध्य अंश में समृद्ध थे एफटी की तुलना में.</p>

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