Name: a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples
Uploaded: 2009-10-01T21:00:00
Duration: 20 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples at JoVE.com

<p class="jove_content"> Эта работа была поддержана Клинические протеомных технологий для Рака инициативу, 5U24CA126477-04. </p>

<ol>
	<li>Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=multiplexed+assays+for+low+abundance+proteins+in+plasma+by+targeted+mass+spectrometry+and+stable+isotope+dilution.">multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.</a> <em style='font-style: italic'>Mol Cell Proteomics</em>. <b>6</b>, 2212-2229 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content"> Этот протокол обеспечивает быстрый метод выделения и идентификации гликопептидов в гликана конкретным образом. Как гликозилирования варьируется широко в организме, особенно в период развития и патогенеза, эта техника может применяться для решения самых разнообразных вопросов. В частности, мы используем метод выборочного обогащения гликопептидов, которые были изменены с раком связаны эпитопы, как первый шаг к открытию биомаркеров. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>We make this in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Human lactoferrin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L0520</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Yeast invertase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>I0408</td>
<td>Trypsin-digest before use</td>
</tr>
<tr>
<td>Oass HLB SPE cartridges</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Waters</td>
<td>WAT094225</td>
<td>1 cc volume</td>
</tr>
<tr>
<td>ZipTip pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>ZTC1 8M0 96</td>
<td>Millipore, C18 for 10 ml pipette</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP154-1</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ammonium bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A6141</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4901</td>
<td>96%</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M8266</td>
<td>98%</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>242853</td>
<td>99.7%</td>
</tr>
<tr>
<td>pH indicator paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>M95903</td>
<td>Range 0-14</td>
</tr>
<tr>
<td>Acetonitrile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A998</td>
<td>99.9%</td>
</tr>
<tr>
<td>Formic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pierce</td>
<td>28905</td>
<td>99%</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate-buffered saline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-136</td>
<td>Without calcium and magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>71289</td>
<td>99.5%</td>
</tr>
<tr>
<td>PNGase F</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>P0705L</td>
<td>Glycerol-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum-filter flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SCGVU05RE</td>
<td>0.2 mm pores</td>
</tr>
<tr>
<td>POROS-AL beads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>1-6028-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Aleuria aurantia</em> lectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1390</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><em>Sambucus nigra</em> agglutinin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>L-1300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium cyanoborohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>296945</td>
<td>5.0 M solution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

a lectin hplc method to enrich selectively-glycosylated peptides from complex biological samples

<p class="jove_content">Гликанов являются важным классом пост-трансляционной модификации. Обычно найти на выделяемые и внеклеточных молекул, гликана структуры сигнала внутреннее состояние клеток. Гликанов на опухолевые клетки, как правило, имеют богатый сиаловой кислоты и фукозы фрагментов. Мы полагаем, что это рак связаны гликана вариантов быть использованы для биомаркеров развития, направленные на диагностику ранних стадий заболевания. Соответственно, мы разработали масс-спектрометрии на основе рабочего процесса, который включает хроматографии на близость матрицы, составленные из лектинов, белки, которые связывают специфические структуры гликана. Лектины Бузина черная (СНС) и алейрий aurantia (AAL), которые связываются сиаловой кислоты и фукозы, соответственно, были ковалентно связан с ПОРОС шариков (Applied Biosystems) и упаковывается в PEEK колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Короче говоря, плазма был исчерпан из четырнадцати наиболее распространенных белков, используя несколько системой удаления сродством (МАРС-14; Agilent). Обедненный плазмы трипсин-переваривается и разделить на проточные и связанных фракций СНС или AAL ВЭЖХ. Фракций лечили PNGaseF для удаления N-связанных гликанов, и проанализированы LC-MS/MS на Elite QStar. Данные были проанализированы с помощью талисмана программного обеспечения. Опытно-конструкторских включены положительные контроли-фукозилированных и sialylated человека гликопептидов и лактоферрин отрицательного контроля высокой маннозы гликопептидов с Saccharomyces CEREVISIAE-, которые были использованы для мониторинга специфичность лектина захвата. Основные характеристики этого рабочего процесса включает воспроизводимость происходит от формата ВЭЖХ, положительной идентификации в плен и PNGaseF обработанных гликопептидов от их мотивов deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr и качество оценки с использованием гликопротеина стандартам. Протокол оптимизации также включены определения соответствующего соотношения исходного материала для колонки мощностью, выявление наиболее эффективных захвата и элюции буфера и мониторинга PNGaseF обращения с целью обеспечения полного Дегликозилирование. Будущие направления деятельности включают в себя использование этого рабочего процесса для выполнения масс-спектрометрии основе экспериментов открытие на плазму от больных раком молочной железы и контроль физических лиц.</p>

Watch this Scientific Journal Video about A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples at JoVE.com

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

<p class="jove_content">Лектина-сопряженных ПОРОС шарики используются для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Гликопептид стандарты послужили положительные и отрицательные контроли. МАРС-14 исчерпан, трипсин-переваривается человеческой плазмы хроматографировали и проточные (FT) и связанной фракций, собранных для ESI-LC-MS/MS анализов. Гликопептиды обогащались связанной фракции по сравнению с FT.</p>

Лектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии обогатить Выборочно-гликозилированного пептидов из сложных биологических образцов

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Research

JoVE Journal

Biology

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Т-волны ионной подвижности-масс-спектрометрии: Основные экспериментальные процедуры для комплексного анализа белков

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Пептидов из библиотеки Показать Фаг Модуляция экспрессии генов в клетки и мезенхимальные Потенцирует остеогенез в Unicortical костных дефектов

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through <em>E. coli</em>

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

Логика, экспериментальные шаги, и потенциал Гетерологичная природного биосинтеза продукта Благодаря комплекса антибиотик эритромицин производится через<em&gt; E. палочки</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

A Method for Microinjection of <em>Patiria minata</em> Zygotes

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Метод микроинъекции<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Зиготы

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Очищение нечистых: секвенирование метагеномов и Metatranscriptomes от сложных образцов животного связано

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

Гибридная ДНК Добыча Метод для качественной и количественной оценки бактериальных сообществ из мяса птицы Образцы продукции

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Удаление экзогенных материалов из внешней части замороженных ядер по расследованию Древние биологических сообществ таил Внутри

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Подготовка и наблюдение Толстые биологических образцов с помощью сканирующего трансмиссионной электронной томографии

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Method for Labeling Transcripts in Individual <em>Escherichia coli</em> Cells for Single-molecule Fluorescence <em>In Situ</em> Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Метод для маркировки стенограммы в клетках отдельных <em>кишечная палочка</em> для одной молекулы флуоресценции <em>в Situ</em> гибридизация экспериментов

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Quasi-metagenomic Analysis of <em>Salmonella</em> from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Квази метагеномных анализ <em>сальмонеллы</em> от пищевых продуктов и экологические пробы

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...