Name: culture and maintenance of human embryonic stem cells
Uploaded: 2009-12-22T16:50:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

1. Underhåll: Beaktande kulturer under luppen <ol><li> Ta en tallrik hES celler från 37 ° C inkubator och ta med till mikroskop. </li><li> Observera kolonier med låg effekt, med 2x eller 5x förstoring, för att bedöma den samlade kulturen kvalitet. Observera följande: normal medelstora färg, avsaknad av synliga föroreningar, övergripande koloni storlek, kvalitet och täthet, och alla andra observationer. </li><li> Observera medelstora färgförändringar. På grund av förändringar i pH och utarmning av näringsämnen i mediet efter en natts inkubation med hES-celler, kommer mediet ändras från en röd nyans till en &quot;halm&quot; färg. Om mediet visas lila, har en grundläggande pH-skift inträffat. Om skivan verkar extremt gult, har mediet försurade. Mycket gult medium kan vara ett resultat av extremt trångbodda kolonier i brunnen eller förorening. Mediet skall vara klar vid alla tillfällen. Även om en viss nivå av cellfragment på medellång är normalt, bör den visas aldrig grumligt. Om en hög cellfragment observeras, är kulturen inte hälsosamt och kan vara förorenade. </li><li> Om kulturerna inte kräver underhåll eller passaging, kan de tas till den biologiska säkerheten skåpet matas (se avsnitt 2). </li><li> Om kulturerna innehåller mer än ca 10% skilja kolonier bör cellerna &quot;städas upp&quot; genom att manuellt ta bort differentierade områden (se avsnitt 3). </li><li> Om kulturerna innehåller stora eller täta kolonier, eller MEF matare skiktet är mer än 12 dagar gamla, bör cellerna passerats (se avsnitt 4). </li></ol> 2. Utfodring hES-celler <ol><li> I en steril biologisk säkerhet skåp, ta bort locket på kulturen skålen och aspirera det använda mediet. Låt inte spetsen på pipetten att röra någon del av plattan än direkt i brunnarna. Om det finns någon oro för smitta, byt till en ny, steril pipett. </li><li> Använd en steril glas pipett, tillsätt lämplig mängd uppvärmd hES cellkulturmedium i varje brunn. För kulturer i en 6-brunnar, tillsätt 2,5 mL medel per brunn. </li><li> Återgå plattan till inkubatorn att stanna vid 37 ° C och 5% CO 2. </li></ol> 3. Ta bort Differentiering från hES cellkulturer <ol><li> Förvandla 9 tums glas Pasteur pipetter i plocka verktyg genom gjutning tipsen över kontrollerad eld i ett alkohol-brännare. Se till att spetsen på pipetten är förseglad för att förhindra förorening och rundade för att undvika repor i plast av kulturen skålen. Sterilisera plocka verktyg före användning med hjälp av UV-ljuskällan i den biologiska säkerhetsskåp eller plocka kapsling. </li><li> Ta bort de differentierade områden. Differentiering förekommer ofta i bara en del av en hES cell koloni, oftast längs kanterna eller som isolerade platser i centrum. Om endast en del av en koloni är särskiljande, behöver bara de differentierade området ska tas bort. Differentiering kan ofta lyfta av plattan i en &quot;klibbiga&quot; blad, och det är bra att först separera differentierade celler från resten av kolonin genom att rita en linje genom kolonin med slutet av plockning verktyg. </li><li> När bitar av kolonin är separerade, försiktigt glida plockning verktyg längs plattan bort oönskade celler. Se till att inte skrapa bort för mycket av MEF matare lagret mellan kolonierna i denna process. </li><li> När alla de differentierade cellerna tas bort från plattan (och flytande på medellång), tillbaka kulturen till biologisk säkerhet skåp. Sug mediet innehåller differentierade celler och ersätta med färsk hES cellkulturmedium. </li></ol> 4. Passaging hES-celler Enzym Inkubation <ol><li> I en steril biologisk säkerhet skåp, ta bort locket på 6-bra kultur skålen och aspirera det använda mediet från brunnarna ska passerats. Låt inte spetsen på pipetten att röra någon del av plattan än direkt i brunnarna. </li><li> Använd en steril glas pipett tillsätt 1 ml uppvärmd kollagenas IV till varje brunn för att bli passerats. </li><li> Återgå plattan i 37 ° C inkubator i 5 minuter. </li></ol> Skrapning och samlande hES-celler <ol start="4"><li> Efter inkubering av cellerna med kollagenas, observera kolonierna under mikroskop. Det enzym bör medföra en subtil men märkbar förändring i kolonin kanterna. </li><li> I den biologiska säkerhetsbänk försiktigt aspirera enzymet från varje brunn och ersätta med 2,0 ml hES cellkulturmedium. </li><li> Tips odlingsplattan något mot dig och ta upp 2,0 ml medium i den första brunnen med ett 5 ml glasflaska pipett. Håll pipett vinkelrätt mot botten av plattan, försiktigt glida pipettspetsen över väl medan långsamt släppa mediet. </li><li> Upprepa skrapning och pipetting rörelse 3-4 gånger tills alla kolonier har tagits bort från brunnen. Pipettera försiktigt för att undvika att bryta upp kolonier i för små bitar. När cellerna har tagits bort från den första brunnen, lämna innehållet i brunnen och börja skrapa celler bort av nästa brunn. </li><li> När alla de brunnar som passerats har skrapats, pool mediet innehåller kolonin bitar från varje brunn i en steril 15 ml koniska rör. </li><li> Skölj skrapas brunnar genom att tillsätta 1 mL av hES cellkulturmedium i varje brunn. Samla här Skölj och överföring till den koniska röret. </li><li> Pipettera cellerna försiktigt i röret för att bryta upp kolonin bitarna upp till önskad storlek. </li><li> Centrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 x g. </li></ol> Plätering hES Cell celler <ol start="12"><li> Medan hES celler i centrifugen, förbereda en ny 6-och MEF matare plattan. Etikett plattan med lämplig hES cellinformation: cellinje, ny passage nummer och passage datum. Aspirera MEF mediet från brunnarna och tillsätt 1,0 mL PBS i varje brunn. Vagga försiktigt bufferten runt brunnarna och aspirera PBS tvätt. Tillsätt 1,5 mL hES cellkulturens medium till varje brunn och ställ in plattan åt sidan. </li><li> När hES-celler är klar centrifugering, ta tuben tillbaka till biologisk säkerhet skåp. Aspirera supernatanten försiktigt så att inte störa den löst packade cellpelleten. </li><li> Resuspendera cellerna i pellets med tillräckligt med medel för 1 mL hES cellkulturmedium per brunn vara klädd. När delas upp i sex nya brunnar, suspendera pelleten i 6 ml medium. </li><li> Försiktigt och jämnt tillsätt 1 ml av cellsuspensionen till var väl förberedd av MEF matare plattan. </li><li> Placera plattan i 37 ° C inkubator och skjut försiktigt plattan framåt till bakåt och från sida till sida att fördela de celler i hela väl. </li><li> Låt cellerna att fästa vid 37 ° C över natten. </li></ol> 5. Representativa resultat: Odifferentierade hES celler är små, tätt packade, och består vanligtvis av större och mer utspridda celler. Differentiering kan ske inom en koloni (Figur 1A) eller mellan kolonier (Figur 3B). Olika morhopologies kan ses under låg förstoring i mikroskop. En bra cellmorfologin, som visas i figur 2A, innehåller små, tätt packade celler som växer i ett monolager. Celler bör ha rena, definierade kanter, med liten eller ingen differentiering. De celler som visas i figur 2B är klara för passaging, och de celler som visas i figur 2C är överfulla. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Differentiering vid HES kulturer. (A) differentiering av en koloni (B) differentiering mellan kolonier. <img src="/files/ftp_upload/1427/1427fig2.jpg" alt="Figur 2" /> Figur 2. Morfologier sett i hES kulturer. (A) bra cellmorfologin (B) hES celler som är redo för passaging (C) överfulla celler.

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).</li></ol>

Sterilitet måste underhållas hela tiden när man arbetar med HES celler. Rengör och sterilisera biologisk säkerhet skåp och all utrustning före användning. Alla reagenser måste filtreras med hjälp av en 0,22 ìm porstorlek filtret före användning. Användningen av antiboiotics vid HES cellkultur är inte nödvändig och bör undvikas. En separat miljö bör inrättas som en designerad plocka station. Den sterila kapsling för stationen kan vara en statisk inhägnad (t.ex. ett PCR-arbetsstation) med en UV-ljuskälla, ett laminärt flöde huva, eller en biologisk säkerhet skåp. En dissekera mikroskop inuti plocka stationen behövs för att observera de kolonier som de differentierade områden tas bort. Den främre glas panel en statisk inhägnad eller ett biologiskt säkerhetsbänk måste ändras för att möjliggöra okularen i mikroskop för att förlänga genom panelen utan att kompromissa korrekt luftflöde och sterilitet. För att bibehålla sunda hES cellodlingar, måste cellerna passerats vid den optimala tidpunkten, typiskt var 4-7 dagar. Vid denna tid kolonierna har nått sin maximala storlek och kan börja gå samman. Sammanslagna kolonier kan öka graden av differentiering i kulturen. Split nyckeltal faller i allmänhet från 1:03 till 01:05, beroende på antalet kolonier pläterade, expansionstakt och villkor kultur. Overplated kolonier (delningsfaktorn för låg) kommer sannolikt att slås samman för tidigt och måste passerats innan de når sin maximala storlek. Kulturer på en MEF matare lager som är mer än 2 veckor gamla måste passerats på nya MEFs som kommer att stödja odifferentierad tillväxt och spridning. Sedan differentiering naturligt i hES cellkulturer, är en liten summa förväntas. Frekvent eller överdriven differentiering kan uppstå om de kulturer inte får lämplig vård. Cellerna måste matas varje dag, bör överväxt mellan passager undvikas. Använd alltid färska reagenser. Alla medier, MEFs och reagenser måste användas inom 14 dagar för att undvika odifferentierade hES celltillväxt. Nya massor av reagens, som Knockout Serum Replacement, FBS och MEFs, bör säkerhetskontrolleras innan användning. Kom ihåg att alla differentierade celler inte avlägsnas före passaging kommer att överföras till den nya kulturer. Försök också att hålla cellerna vid 37 ° C när det är möjligt. Minimera den tid de celler tillbringar utanför kuvösen (t.ex. på mikroskop scenen eller i den biologiska säkerhetsskåp.) En uppvärmd mikroskop skede kan vara mycket fördelaktigt om cellerna kommer att vara av inkubatorn under längre perioder. När observera hES cellkulturer i mikroskop, först bedöma den övergripande kvaliteten och storleken på kolonierna vyn med en låg effekt (2x eller 5x) mål. Om potentiellt differentierade celler observeras vid låg effekt, bekräfta de differentierade morfologi med hjälp av en högre förstoring mål (10X). Omedelbart efter att ta bort differentiering kan kanterna av kolonierna hackiga eller skadade. Inkubera kolonierna natten i nya medium till att återstående odifferentierade celler att återhämta sig. Utan påverkan av differentiering i kulturen, kommer dessa kvarvarande kolonier fortsätta att föröka sig normalt. Om möjligt, börja experiment med låga passagen hES celler. Karyotyp cellerna före och efter alla större experiment.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>D-MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11965-092</td>
<td>For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>Heat-inactivated 
For MEF medium</td>
</tr>
<tr>
<td>D-MEM/F-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11330-057</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout&trade; Serum Replacement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10828-028</td>
<td>Pre-screen to ensure support of hES cells</td>
</tr>
<tr>
<td>bFGF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>03-0002</td>
<td>Use at [4 ng/mL] final</td>
</tr>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11140-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-081</td>
<td>200 mM (100X) 
Use at [1X] final
</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>Without Ca2+ or Mg2+</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase IV</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17104-019</td>
<td>Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12</td>
</tr>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Type A, Porcine</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Defined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HyClone</td>
<td>SH300.70.01</td>
<td>For freezing medium</td>
</tr>
<tr>
<td>6-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140675</td>
<td>For general culture</td>
</tr>
<tr>
<td>4-well plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>For thawing</td>
</tr>
<tr>
<td>5 mL glass pipets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-27E</td>
<td>Individually wrapped</td>
</tr>
<tr>
<td>15 mL conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Polypropylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Pasteur pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-678-20D</td>
<td>9&#x201D; glass</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

culture and maintenance of human embryonic stem cells  

Mänskliga embryonala stamceller (HES) celler måste övervakas och vårdas för att bibehålla friska, odifferentierade kulturer. Vid minst måste de kulturer matas varje dag genom att utföra en komplett medelstora förändring för att fylla på förlorade näringsämnen och för att hålla kulturer fri från oönskad differentiering faktorer. Även en liten mängd av differentiering är normalt och förväntat i kulturer stamceller bör kultur rutinmässigt saneras genom att manuellt ta bort, eller &quot;plocka&quot; differentierade områden. Identifiera och ta bort överskott differentiering från hES cellkulturer är viktiga tekniker för att upprätthålla en frisk population av celler.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

Detta protokoll visar hur att bevara friska, odifferentierade embryonala stamceller (ES-celler).

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Research

JoVE Journal

Biology

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Spridning av mänskliga embryonala stamceller (ES-celler)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sökning efter Mitokondriell komplex aktivitet på mänskliga embryonala stamcellslinjer

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Kromosomala Sprid Beredning av mänskliga embryonala stamceller för karyotypning

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Nedfrysning och upptining mänskliga embryonala stamcellslinjer

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Ödet Kartläggning av mänskliga embryonala stamcellslinjer som Teratom Bildning

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...