Name: fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00
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Agradecemos al Dr. Nicola Wiethölter para la preparación y tinción de 1-D geles. Este trabajo fue financiado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND y SM) y apoyado por una beca de investigación de la Fundación para Manchot Jürgen Key.

Parte 1: en dos dimensiones (2-D) usando electroforesis en gel de taza de carga <ol><li> IPG-tira la rehidratación y el isoelectroenfoque (IEF) <ul><li> Rehidratar geles Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 cm) en más de 125 soluciones de rehidratación l [7 M urea, 2 M tiourea, CHAPS 4%, 50 mM hydroxyethyldisulfide y el 2% IPG Buffer pH 6.11] utilizando la bandeja DryStrip Immobiline Reswelling para por lo menos 10 horas. </li><li> Disolver la muestra proteína precipitada en tampón de muestra IEF [7 M urea, 2 M tioure...

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	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Innovadora o simplemente un protocolo de Coomassie? Por el momento existen varios protocolos para los procedimientos de tinción con Coomassie Brilliant Blue. La mayoría de ellos consecuencia de las modificaciones de menor o mayor de uno de los protocolos más utilizados por Neuhoff y colegas 2. También protocolo Kang está basado en la fórmula de Neuhoff. Pero en realidad es un método alternativo de Coomassie tinción para la investigación proteómica? Vamos a imagen dos cue...

<table border="1" ><tr><td> Nombre del producto </td><td> Empresa </td><td> Catálogo N º </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Para el IEF y SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip geles </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Se puede utilizar incluso dos años después de la fecha de caducidad. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling bandeja </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> No utilice disolventes orgánicos. Diseñado para 7-18 cm IPG tiras. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Incluye una bandeja de electrodos, porta-electrodos, un ánodo y el cátodo, alineador y un bar de la Copa de la muestra y copas de muestra. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL fuente de alimentación </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Fuentes de voltaje de hasta 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II unidad de electroforesis </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Electrodos móviles permiten IEF en tiras IPG de toda la longitud (24.07 cm IPG strips) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel sistema de doble S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE en 10x10 cm mini-gel de formato. Gel de la cámara incluye un sistema de refrigeración. </td></tr><tr><td> De Coomassie coloidal G-250 tinción: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> tinción con tapas de cierre </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Se adapta para mini-geles. Apilables en la coctelera. </td></tr><tr><td> sulfato de aluminio-18-hidrato </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Hicimos mejor experiencia con Merck. Sólo disponible en el paquete de 5 kg. </td></tr><tr><td> de ácido ortofosfórico </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> Se vende en botellas de vidrio. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) es un colorante utilizado para la visualización de proteínas separadas por SDS-PAGE, que ofrece un procedimiento de tinción simple y cuantificación de alta. Además, es totalmente compatible con la identificación de proteínas por espectrometría de masas. Pero a pesar de estas ventajas, el BCB se mira para ser menos sensible que la plata y coloraciones de fluorescencia y por lo tanto, rara vez se utiliza para la detección de proteínas en analíticas proteómicas a base de gel. Mejoras en varios de los originales una Coomassie protocolo se han hecho para aumentar la sensibilidad de la broca. Dos importantes modificaciones fueron introducidas para mejorar la detección de proteínas poco abundantes mediante la conversión de las moléculas de colorante en las partículas coloidales: En 1988, Neuhoff y sus colegas aplicaron 20% de metanol y una mayor concentración de sulfato de amonio en el CBB G-250 basado en solución de tinción 2, y en 2004 al Candiano et. establecido con Blue Silver CBB G-250 con ácido fosfórico en la presencia de sulfato de amonio y metanol 3. Sin embargo, todas estas modificaciones sólo permiten una detección de la proteína de aproximadamente 10 ng. Un protocolo muy fameless para la tinción de Coomassie coloidal fue publicado por Kang et al. En 2002 en el que modificaron coloidal Neuhoff el protocolo de tinción con respecto a la CBB complejantes. En lugar de sulfato de amonio se utiliza sulfato de aluminio y el metanol fue sustituido por el 4 de etanol menos tóxicos. La base de aluminio nuevas manchas en el estudio de Kang mostró mayor sensibilidad que detecta tan bajo como 1 ng / banda (fosforilasa b) con una variación poco de sensibilidad en función de las proteínas. En este sentido, demostrar la aplicación del protocolo de Kang para la tinción coloidal rápida y sensible de Coomassie de proteínas en la realización de análisis. Vamos a ilustrar el protocolo rápida y sencilla con dos dimensiones geles realizada de forma rutinaria en nuestro grupo de trabajo.

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Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Este vídeo se popularizar un Coomassie coloidal G-250 protocolo de tinción de acuerdo con Kang<em&gt; Et al.</em&gt; Para la detección de la proteína promedio de 4 ng en geles. La tinción se completa en 2 horas y sin ningún esfuerzo. Nosotros usamos el protocolo de Kang para fines de análisis en gel a base de la proteómica.

Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Research

JoVE Journal

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