Name: fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Vi tackar Dr Nicola Wiethölter för att förbereda och färgning av 1-D gel. Detta arbete har finansierats av ett stipendium från Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 till ND och SM) och stöds av ett forsknings-stipendium från Jürgen Manchot Stiftung till ND.

Del 1: Två-dimensionella (2-D) gelelektrofores med cup-loading <ol><li> IPG-strip rehydrering och isoelektrisk fokusering (IEF) <ul><li> Rehydrera Immobiline DryStrip geler, pH 6-11 (7 cm) i 125 l vätskeersättning [7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 50 mm hydroxyethyldisulfide och 2% IPG pH 6-11] med Immobiline DryStrip Reswelling fack för minst 10 timmar. </li><li> Lös fälls protein provet i IEF prov buffert [7 M urea, 2 M tiourea, 2% käkar, 2% ASB-14, 50 mm hydroxyethyldisulfide och 2% IPG pH 6-11] vilket motsv...

<ol>
	<li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips.">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li><li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+Silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li><li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li><li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels.">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li></ol>

Innovativ eller bara en annan Coomassie protokoll? Just nu finns det flera protokoll för färgning förfaranden Coomassie Brilliant Blue. De flesta av dem beror på mindre eller större ändringar av ett av de vanligaste protokollen som Neuhoff och kollegor 2. Även Kangs protokoll baserat på Neuhoff formel. Men är det verkligen ett alternativ Coomassie färgning metod för proteomik forskning? Vi kommer bild två huvudfrågor, detektionsgräns och användbarhet, till bevis att...

<table border="1" ><tr><td> Namn på produkt </td><td> Företag </td><td> Katalog Nr </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> För IEF och SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip geler </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> Kan även användas 2 år efter utgångsdatum. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Reswelling fack </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> Rengör inte med organiska lösningsmedel. Avsedd för 7-18 cm IPG-remsor. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> Inkluderar en bricka, elektrodhållare, anod och katod elektroder, Aligner och provkopp bar och koppar prov. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL Power Supply </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> Levererar spänning upp till 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II elektroforesenhetens </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> Flyttbara elektroder aktivera IEF i IPG remsor av alla längd (7-24 cm IPG strips) </td></tr><tr><td> PerfectBlue gel systemet Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE i 10x10 cm mini-gel-format. Gel kammare finns ett kylsystem. </td></tr><tr><td> För kolloidal Coomassie G-250 färgning: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> färgning rätter med lock </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> Passar mini-geler. Stapelbara på shaker. </td></tr><tr><td> aluminiumsulfat-18-hydrat </td><td> Merck </td><td> 1.01102.5000 </td><td> Vi gjorde bästa upplevelsen med Merck. Bara finns i 5 kg förpackning. </td></tr><tr><td> ortofosforsyra </td><td> Prolabos </td><td> 20 624.295 </td><td> Säljs i glasflaskor. </td></tr></table>

fast and sensitive colloidal coomassie g-250 staining for proteins in polyacrylamide gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) är ett färgämne som ofta används för visualisering av proteiner separeras med SDS-PAGE, som erbjuder ett enkelt färgningsproceduren och hög kvantifiering. Dessutom är det helt kompatibelt med masspektrometrisk protein identifiering. Men trots dessa fördelar är CBB anses vara mindre känsliga än silver eller fluorescens stainings och därför sällan används för detektion av proteiner i analytisk gel-baserad proteomik strategier. Flera förbättringar av den ursprungliga Coomassie protokoll 1 har gjorts för att öka känsligheten för CBB. Två större förändringar infördes för att förbättra upptäckten av låga rikliga proteiner genom att konvertera färgen molekyler i kolloidala partiklar: År 1988 tillämpade Neuhoff och kollegor 20% metanol och högre halter av ammonium sulfat i CBB G-250 baserad färglösning 2, och 2004 Candiano et al. etablerade Blå Silver med CBB G-250 med fosforsyra i närvaro av ammoniumsulfat och metanol 3. Trots alla dessa ändringar kan bara en upptäckt av cirka 10 ng protein. En allmänt fameless protokoll för kolloidala Coomassie färgning publicerades av Kang et al. År 2002 där de ändrade Neuhoff är kolloidal protokoll CBB färgning om komplexbildande ämnen. Istället för ammoniumsulfat de använde aluminiumsulfat och metanol ersattes av den mindre giftiga etanol 4. Den nya aluminium-baserade färgning i Kangs studie visade överlägsen känslighet som upptäcker så lågt som 1 ng / bandet (phosphorylase b) med liten känslighet varierar beroende på proteiner. Här visar vi tillämpa Kangs protokoll för snabba och känsliga kolloidala Coomassie färgning av proteinerna i analytiska ändamål. Vi kommer att illustrera den snabba och enkla protokoll med hjälp av tvådimensionella geler rutinmässigt i vår arbetsgrupp.

Watch this Scientific Journal Video about Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels at JoVE.com

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Denna video ska popularisera en kolloidal Coomassie G-250 färgningsprotokollet enligt Kang<em&gt; Et al.</em&gt; För upptäckt av genomsnitt 4 ng protein i geler. Färgningen är klar inom 2 timmar och utan ansträngning. Vi använder rutinmässigt Kangs protokoll för analytiska ändamål i gel-baserad proteomik.

Snabb och känslig Kolloidal Coomassie G-250 Färgning för proteiner i polyakrylamidgeler

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining Proteins in Gels

Infärgning Proteiner i Geler

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

Metod för hela berget antikropp färgning i Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturering Urea polyakrylamidgelelektrofores (urea SIDA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Mätning Snabb Kalcium flöden i Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi för känsliga, storskaliga kvantitativa Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Utveckling av ett kolloidalt guld-baserade immunokromatografisk testremsa för detektion av Cetacean myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

En snabb Lufttorka släppa Kromosomberedning som lämpar sig för FISH i växter

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Detektering av modifierade former av cytosin Använda Sensitive Immunohistokemi

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...