Name: isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging
Uploaded: 2009-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הגרמני הקרן הלאומית למדע (DFG) ועל ידי המכון הפדרלי הערכת סיכונים (BFR, גרמניה).

על כל עיצוב של פרוטוקול המכיל ארבעה שלבים גדולים מתואר באיור 1. כל הצעדים מתוארים בפירוט מלא. בידוד נייד, התמרה והתרבות, ואחריו הדמיה confocal כ -24 שעות מאוחר יותר היא זמנים רצופים חובה. הבנייה וירוס צריך להיעשות לפני בידוד התא ומשמש אז עבור התמרה גנטית. <p class="jove_title" style=";te...

<ol>
	<li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).</li><li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography.">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).</li><li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+(shRNA)+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes.">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li></ol>

ההליך המתואר עבור בידוד של עכברוש cardiomyocytes ניתן להתאים מינים אחרים, כגון עכבר 4, במידת הצורך. פרמטר שצריך הסתגלות היא לערבב אנזים לעיכול (ראה להלן), וכן את משך העיכול. שימו לב כי תאים של כמה מינים (עכבר למשל) עשוי להיות שביר יותר מאחרים (למשל חולדה). <p class="jove_content" styl...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anesthesia solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 &mu;l Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)</td>
</tr>
<tr>
<td>Citrate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Liberase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F. Hoffmann&#x2010; La Roche Ltd.</td>
<td>11988476 001</td>
<td>500 &mu;l stock solution in 15 ml solution A (stock solution:
10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 200 &mu;M CaCl2 and 0.1% DNase solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B1/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1:1 mixture of solution A and solution B</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma&#x2010; Aldrich Co.</td>
<td>D4527</td>
<td>Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris&#x2010;HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol</td>
</tr>
<tr>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>E1270</td>
<td>1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL
medium M199</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture medium M199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PAA</td>
<td>E15&#x2010;834</td>
<td>Medium M199 supplemented with 1 &mu;l/ml ITS solution and 20 &mu;l/ml penicillin&#x2010;streptomycin solution (5000 units/ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>ITS solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 &#x03BC;l Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear
solution. Aliquots can be frozen.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tyrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;l 10&#215;PCR&#x2010;Buffer, 5 &mu;l MgCl2 (25 mM), 2 &mu;l forward primer, 2 &mu;l reverse primer, 1 &mu;l dNTP&#180;s (10 mM each), 33 &mu;l H2O, 1 &mu;l DMSO, 1 &mu;l Taq&#x2010;DNA polymerase for each sample</td>
</tr>
<tr>
<td>LB&#x2010;Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Pac I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0547L</td>
<td>preparation: 50 &mu;g DNA, 5 &mu;l 10&#215;buffer, 0.5 &mu;l 100&#215;BSA,
0.75 &mu;l Pac I, fill with H2O up to final volume of 50&mu;l</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging

Myocytes לב מבודד בלב מבוגר הן מקובלת כמודל איפשהו באמצע הדרך בין לתאי שריר עובריים בילוד מצד אחד לב עובד על השני. לפיכך, cardiomyocytes לשמש מודלים טוב פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה הסלולר לב, לחקירות התרופות, כמו גם למחקר של מודלים של בעלי חיים מהונדס. כאן אנו מתארים שיטה לבודד את התאים מן הלב. יתר על כן אנו מראים כיצד מניפולציה גנטית על myocytes לב יכול להתבצע ללא גידול חיה מהונדס: זהו שילוב של תרבות ארוכת טווח (1 שבוע) ו - העברת גנים adenoviral. האחד האחרון מתואר מהקמת הנגיף התמרה של התאים. זה יכול לשמש לביטוי של biosensors מקודדים גנטית (GEBs), חלבונים היתוך ניאון, אלא גם על ביטוי החלבון על פני מטה הרגולציה, למשל באמצעות RNAi. כאן אנו מספקים דוגמה לביטוי של חלבון היתוך מכתים מבנה subcellular (Golgi). ביטוי חלבון כזה יכול להיות דמיינו ידי הדמיה confocal של Z-ערימות לשיקום-3D של מבנים subcellular. פרוטוקול מורכב המדינה-of-the-art בתרבות התא, ביולוגיה מולקולרית ביופיזיקה ובכך מספק גישה לחקר אופקים חדשים קרדיולוגיה הסלולר.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging at JoVE.com

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

תרבות ראשונית של הלב Myocytes למבוגרים עכברוש

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...