Name: isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging
Uploaded: 2009-09-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging at JoVE.com

Bu çalışma, Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG) ve Federal Risk Değerlendirme Enstitüsü (BfR Almanya) tarafından desteklenmiştir.

Dört önemli adımlar içeren protokol tüm tasarım üzerinde Şekil 1&#39;de tasvir edilmiştir. Tüm adımlar tam ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Konfokal görüntüleme ile yaklaşık 24 saat takip Hücre izolasyonu, iletimi ve kültür, daha sonra üst üste ve zorunlu bir zaman çizelgesi. Virüs yapımı öncesinde hücre izolasyonu yapılmalı ve daha sonra genetik transdüksiyon için kullanılır. 1. Sıçan kalp yetişkin kardiyak miyositler izolasyonu <ol><li> Yetişki...

<ol>
	<li>Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).</li><li>Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Drosophila+melanogaster+pupae+with+mesoscopic+fluorescence+tomography.">In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography.</a> Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).</li><li>Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).</li><li>Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+delivery+of+short+hairpin+RNA+(shRNA)+mediates+efficient+gene+silencing+in+terminally+differentiated+cardiac+myocytes.">Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes.</a> Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).</li></ol>

Sıçan kardiyomiyositlerinin izolasyonu için açıklanan prosedür, gerekirse diğer türler, örneğin fare 4 adapte edilebilir. Uyarlanması gereken bir parametre sindirim için enzim karışımı (aşağıya bakın) ve aynı zamanda sindirim süresi. Bazı türler (örneğin fare) hücreler, diğerleri (örneğin, sıçan) daha kırılgan olabilir farkında olun. Kollajenaz seçimi muhtemelen izolasyon prosedürü en önemli adımdır. Hemen hemen hiçbir partiden partiye var...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Anesthesia solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 &mu;l Rompun (2% Xylazinhydrochlorid)</td>
</tr>
<tr>
<td>Citrate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution A+</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Liberase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F. Hoffmann&#x2010; La Roche Ltd.</td>
<td>11988476 001</td>
<td>500 &mu;l stock solution in 15 ml solution A (stock solution:
10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.)</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Content of solution A plus 200 &mu;M CaCl2 and 0.1% DNase solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Solution B1/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1:1 mixture of solution A and solution B</td>
</tr>
<tr>
<td>DNase solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma&#x2010; Aldrich Co.</td>
<td>D4527</td>
<td>Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris&#x2010;HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol</td>
</tr>
<tr>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular matrix protein (ECM) solution</td>
<td>E1270</td>
<td>1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL
medium M199</td>
</tr>
<tr>
<td>Culture medium M199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PAA</td>
<td>E15&#x2010;834</td>
<td>Medium M199 supplemented with 1 &mu;l/ml ITS solution and 20 &mu;l/ml penicillin&#x2010;streptomycin solution (5000 units/ml)</td>
</tr>
<tr>
<td>ITS solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 &#x03BC;l Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear
solution. Aliquots can be frozen.</td>
</tr>
<tr>
<td>Tyrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered</td>
</tr>
<tr>
<td>Master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;l 10&#215;PCR&#x2010;Buffer, 5 &mu;l MgCl2 (25 mM), 2 &mu;l forward primer, 2 &mu;l reverse primer, 1 &mu;l dNTP&#180;s (10 mM each), 33 &mu;l H2O, 1 &mu;l DMSO, 1 &mu;l Taq&#x2010;DNA polymerase for each sample</td>
</tr>
<tr>
<td>LB&#x2010;Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Pac I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>New England Biolabs</td>
<td>R0547L</td>
<td>preparation: 50 &mu;g DNA, 5 &mu;l 10&#215;buffer, 0.5 &mu;l 100&#215;BSA,
0.75 &mu;l Pac I, fill with H2O up to final volume of 50&mu;l</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging

Yetişkin kalpleri izole kardiyak miyositler, yaygın bir model bir yere, bir tarafta, embriyonik ve neonatal kas hücreleri ve diğer çalışan bir kalp arasındaki yarım olarak kabul edilir. Böylece, kardiyomiyositlerde kardiyak hücre fizyolojisi ve patofizyolojisi için iyi bir model olarak hizmet, ilaç gibi araştırmalar için transgenik hayvan modellerinde keşif için. Burada kalp hücreleri izole bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca kardiyak miyositler bir genetik manipülasyon transgenik hayvan yetiştiriciliği olmadan nasıl yapılabilir: Bu uzun vadeli bir kültür kombinasyonu (1 hafta) ve adenoviral gen transferi. Ikinci bir virüs inşaat hücrelerinin transdüksiyon açıklanmıştır. Bu ifade için genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs), floresan füzyon proteinleri kullanılır, ama aynı zamanda ifade üzerinde protein ve düzenleme, örneğin RNAi kullanarak aşağı olabilir. Burada bir füzyon proteinin hücre içi yapısı (Golgi) boyama ifade için bir örnek sağlar. Böyle bir protein ekspresyonu, hücre içi yapıların bir 3D-yeniden inşası için z yığınlarının konfokal görüntüleme ile görüntülenebilir. Protokol, hücre kültürü, moleküler biyoloji ve biyofizik state-of-the-art oluşur ve böylece hücresel kardiyoloji yeni ufuklar keşfetmek için bir yaklaşım sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging at JoVE.com

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Yetişkin, kardiyak miyositler hayvan kalpleri izole edilebilir ve birkaç gün kültüre temel hücrelerdir. Bu kültür süre içinde adenoviral gen transferi, genetik olarak kodlanmış biyosensörler (GEBs) ya da floresan füzyon proteinleri ifade etmek için kullanılır. Her iki yaklaşım konfokal mikroskobi ile hücresel soruşturma izin verir.

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Yetişkin Sıçan Kalp miyositler İlköğretim Kültür

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Erişkin Kardiyak Fibroblastlar ve Miyofibroblastların İzolasyon ve Karakterizasyonu

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Ca2+ geçici ve L-tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...