Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نعترف بامتنان الأجهزة الجزيئية التقنيات التحليلية / النعش على تبرعه السخي من الكواشف المستخدمة في الدراسة. ونحن نشكر أيضا الموارد الأنسجة مركز هارفارد لتوفير أنسجة الدماغ البشري بعد الوفاة <strong>التمويل</strong> : RO1MH76060 وP50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد رعت إنتاج هذه المادة عن طريق الفيديو بواسطة تقنيات الحياة. </p>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> هنا ، ونحن نحاول تخصيص بروتوكول لاستخراج الخلايا متجانسة من السكان غير متجانسة نسيج المخ بعد الوفاة باستخدام نظام XT النعش ومجموعات ذات صلة استخراج الحمض النووي الريبي. على النحو المبين أعلاه ، أحرزنا بعض التعديلات على البروتوكولات الأصلية التي تقدمها الشركة ، من أجل تحقيق أقصى قدر من الحمض النووي الريبي النزاهة. واسر واحد من الخلايا الناجح يعتمد فقط على تحقيق الاستفادة المثلى من الخطوات السابقة لالتقاط من أجل تحقيق أقصى قدر من خلايا الحمض النووي الريبي جيدة. هذه الخطوات تشمل مختلف المعايير المرتبطة الأنسجة sectioning وتلطيخ. باختصار ، فيما يتعلق بإعداد هذه الأنسجة تشمل ما يلي : 1) خفض درجة الحرارة عند التدرج sectioning ، 2) وضع المقاطع فقط 2 لكل شريحة ، 3) القيام بجميع الخطوات الجفاف على الجليد ، 4) واضاف المانع ريبونوكلياز إلى 5 ، وصمة عار) زيادة مدة الجفاف في الإيثانول النهائي 100 ٪ لمدة 3 دقائق. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> فيما يتعلق اسر ، فإننا نرى أن الجمع بين CapSure HS القبعات ، مع البرنامج على وضع ماكرو ، وينبغي ضمان تحقيق أفضل النتائج. بيئة الرطوبة التي تسيطر عليها أمر حاسم لالتقاط الخلايا واحد ، ويقلل من ارتفاع نسبة الرطوبة بشكل كبير الأنسجة &quot;رفع&quot;. درجات الحرارة المرتفعة يمكن أيضا أن يكون لها تأثير سلبي على نوعية الحمض النووي الريبي. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي مع عدة PicoPure ، هناك خطوات غسل اثنين. فمن المهم للتأكد من أن تتم إزالة كافة العازلة يغسل قبل ان ينتقل الى آخر لأنبوب microcentrifuge شطف الحمض النووي الريبي ، لأن أي وجود المخزن في عينتك النهائي ستؤدي في أقل RNA انطلاق لالتضخيم. لضمان ذلك ، ونحن الطرد المركزي الخطوة النهائية لغسل 2.5 دقائق بدلا من دقيقة 2 على النحو المقترح في البروتوكول المقدمة. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للجزء الاكبر ، وكان البروتوكول التضخيم خطي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ومع ذلك ، ينبغي أن تؤخذ نقطتين حاسمة في الاعتبار عند استخدام هذا البروتوكول : 1) في محاولة للحد من الخسائر عن طريق الحمض النووي الريبي نقل الفائض من بين عينات أنابيب ، وذلك فقط باستخدام أنابيب 0.5ml قدمت بالاشتراك مع كتلة 0.5ml في cycler الحرارية و 2) عند نقل العينة إلى العمود تنقية لتنقية [كدنا] ، ومن المؤكد ان تدور باستمرار أنابيب العينات بعد نقل الأولى. وهذا سيؤدي في 2ul - 1 إضافية من العينة إضافة إلى العمود تنقية ، وبالتالي يمكن أن تزيد من الانتعاش [كدنا]. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الاستفادة من هذه المجموعة في نهاية الوسم TURBO البيوتين لوضع العلامات من العينات الخاصة بك آرنا محدودة ، فإننا نقترح إضافة ميكرولتر اضافية قليلة من الماء قبل خطوة الطرد المركزي ، لزيادة الغلة استخراج الحمض النووي الريبي من العمود المسمى. سيكون في الدقيقة إضافية من الطرد المركزي يساعد أيضا في هذا الصدد ، خصوصا إذا كنت تعمل مع الأنسجة المتدهورة ، مثل الأنسجة FFPE. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> ونحن على ثقة من أن هذا البروتوكول سوف تمكن المستخدم لعزل هياكل صغيرة متجانسة ، مثل السكان خلية واحدة ، غير متجانسة داخل أنسجة الدماغ بعد الوفاة. هذا يقلل من آثار التخفيف من الهياكل المحيطة بها وغيرها من أنواع الخلايا ، الموجود في طبقات مختلفة داخل المخ ، مما يؤدي إلى النتائج المستهدفة نحو أنواع معينة من الخلايا قيد التحقيق. كما نوعية RNA الناتجة جيدة بما يكفي للدراسات ميكروأري ، يمكننا أن نبدأ في تحديد التوقيعات الجزيئية المحددة للسكان المتضررين في خلية معينة الحالات المرضية. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p style=";text-align:right;direction:rtl"> اقترحنا للتحقيق في الحد من المادة الرمادية في التلفيف الصدغي العلوي ينظر في مرضى الفصام ، من خلال استجواب ملامح التعبير الجيني للخلايا العصبية الهرمية في الطبقة الثالثة. ومن المعروف أن قشرة الدماغ هي بنية متجانسة بشكل استثنائي يضم مختلف المناطق والطبقات وأنواع الخلايا ، كل منها يتميز متميزة التراكيب الخلوية والجزيئية وبالتالي الفرق ملامح التعبير الجيني. للتحايل على آثار الخلط من التجانس الأنسجة ، واستخدمنا الليزر التقاط microdissection (LCM) من أجل عزل لدينا خلية معينة من نوع الخلايا العصبية أي الهرمي. </p><p style=";text-align:right;direction:rtl"> تم القبض على ما يقرب من 500 العصبونات الهرمية ملطخة Histogene حل التلوين باستخدام نظام أركتوروس LCM XT. ثم تم عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا والقبض على خضع جولتين من T7 المستندة إلى تضخيم الخطية باستخدام النعش / الجزيئية أجهزة مجموعات. أشار LabChip Experion (بيو راد) هلام ومخطط رحلاني نوعية جيدة الحمض النووي الريبي (م) ، ويبلغ طوله نص تمديد 600nt الماضية اللازمة لميكروأرس. وبلغ متوسط ​​كمية مرنا الحصول 51μg ، مع نقاء مقبول متوسط ​​العينة على النحو المبين في النسبة A260/280 ، من 2.5. وعرضت لمحة الجينات البشرية باستخدام مسبار GeneChip X3P مجموعة من Affymetrix. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">نحن تصف العملية باستخدام الليزر التقاط microdissection لعزل واستخلاص الحمض النووي الريبي من السكان خلية واحدة متجانسة ، العصبونات الهرمية ، في الثالث من طبقة التلفيف الصدغي العلوي في العقول بعد الوفاة الإنسان. نحن في وقت لاحق تضخيم خطي (T7 على أساس) مرنا ، ويهجن العينة إلى ميكروأري Affymetrix X3P الإنسان.</p>

الحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي بالسكان خلية واحدة في الإنسان تشريح أنسجة المخ

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

الحصول على البيض من الإناث المورق القيطم

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

عزل النواة من الخلايا العصبية البشرية تشريح أنسجة المخ

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

جيل وحيدة الخلية معلقات من الأنسجة العصبية ماوس

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

بروتوكول إزالة الميكروسيرس من الليزر الذي ينتج RNA عالي الجودة من عظام الماوس الطازجة المجمدة

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

سير العمل البروتيومي الكمي باستخدام رصد التفاعل المتعدد القائم على الكشف عن البروتينات من أنسجة الدماغ البشري

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...