Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content"> Wij dankbaar erkennen Molecular Devices Analytische technologieën / Arcturus voor hun genereuze donatie van reagentia wordt gebruikt voor de studie. We danken ook de Harvard Tissue Resource Center voor het leveren van post-mortem menselijk hersenweefsel <strong>Financiering:.</strong> RO1MH76060 en P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> De productie van deze video-artikel werd gesponsord door Life Technologies. </p>

<p class="jove_content"> Hier proberen we een protocol aan te passen aan homogene cel populaties uittreksel uit heterogene post-mortem hersenweefsel met behulp van de Arcturus XT-systeem en de bijbehorende RNA-extractie kits. Zoals hierboven is aangegeven, hebben we enkele wijzigingen aan de oorspronkelijke protocollen die door het bedrijf, om RNA integriteit te maximaliseren. De succesvolle vastleggen van enkele cellen hangt uitsluitend af van het optimaliseren van de stappen voorafgaand aan de vast te leggen in om een ​​maximale cellen met een goede RNA te bereiken. Deze stappen zijn de verschillende parameters in verband met weefsel snijden en vlekken. Kortom, met betrekking tot het prepareren van weefsels deze omvatten: 1) het verminderen van de temperatuurgradiënt bij snijden, 2) alleen het plaatsen van twee delen per slide, 3) het uitvoeren van alle uitdroging stappen op het ijs, 4) het toevoegen van RNase Inhibitor de vlek, 5) steeds meer de uitdroging duur in de laatste 100% ethanol tot 3 minuten. </p><p class="jove_content"> Met betrekking tot het vastleggen, voelen we dat de combinatie van CapSure HS caps, met de software op macro-instelling, moet een optimaal resultaat. Een vocht-gecontroleerde omgeving is cruciaal voor het vastleggen van enkele cellen, zoals een hoge luchtvochtigheid drastisch vermindert weefsel &quot;lift&quot;. Hoge temperaturen kunnen ook een negatief effect hebben op de RNA-kwaliteit. </p><p class="jove_content"> Tijdens de RNA-isolatie protocol met de PicoPure kit, zijn er twee wasstappen. Het is belangrijk om te controleren dat alle wasbuffer is verwijderd voordat de overdracht aan een andere microcentrifugebuis voor RNA-elutie, zoals elke aanwezigheid van de buffer in uw uiteindelijke steekproef zal resulteren in minder vanaf RNA voor versterking. Om dit te waarborgen, hebben we centrifuge de laatste wasstap voor 2,5 minuten in plaats van 2 minuten zoals voorgesteld in de daarvoor bestemde protocol. </p><p class="jove_content"> Voor het grootste deel, de lineaire versterking protocol was volgens de instructies van de fabrikant. Er dient echter twee cruciale punten in aanmerking worden genomen bij het gebruik van dit protocol: 1) proberen om het verlies van RNA te beperken via meer dan het overbrengen van de monsters tussen de buizen door het gebruik van alleen de 0,5 ml buisjes die in combinatie met een 0,5 ml blok in de thermal cycler , en 2) bij het overbrengen van het monster op de kolom voor zuivering zuivering van cDNA, moet u de spin down monsterbuizen na de eerste overdracht. Dit zal resulteren in een extra 1-2ul van het monster toe te voegen aan de zuivering kolom en kan daarom cDNA herstel te vergroten. </p><p class="jove_content"> Bij het maken van het gebruik van de TURBO end-labelling kit voor biotine-etikettering van uw beperkte ARNA samples, we raden het toevoegen van een extra paar ul van water voor de centrifugatie stap, het vergroten van de gelabelde RNA opbrengst uit de kolom. Een extra minuten van centrifugeren zal ook helpen in dit opzicht, vooral als u werkt met een afgebroken weefsel, zoals FFPE weefsel. </p><p class="jove_content"> We zijn ervan overtuigd dat dit protocol in staat zal stellen de gebruiker in kleine homogene structuren, zoals de enkele cel populaties, binnen heterogene postmortem hersenweefsel te isoleren. Dit vermindert verwateringseffect van de omliggende structuren en andere cel-types in de verschillende lagen in de hersenen, wat leidt tot resultaten gericht op de specifieke celtypen in onderzoek. Omdat de kwaliteit van de resulterende RNA is goed genoeg voor microarray studies, kunnen we beginnen met specifieke moleculaire handtekeningen van specifieke cel getroffen bevolking bij de ziekte van staten lokaliseren. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> We stelden voor om de grijze stof vermindering van de superieure temporale gyrus gezien bij schizofrenie patiënten te onderzoeken, ondervragen door de genexpressie profielen van piramidale neuronen in laag III. Het is bekend dat de cerebrale cortex is een bijzonder heterogene structuur, bestaande uit diverse regio&#39;s, lagen en celtypen, die elk gekenmerkt wordt door verschillende cellulaire en moleculaire samenstelling en dus differentiële genexpressie profielen. Te omzeilen van de verstorende effecten van weefsel heterogeniteit, gebruikten we laser-capture microdissectie (LCM) om onze specifieke cel-type dwz piramidale neuronen te isoleren. </p><p class="jove_content"> Ongeveer 500 piramidale neuronen gekleurd met de Histogene kleuroplossing werden gevangen met behulp van de Arcturus XT LCM-systeem. RNA werd vervolgens geïsoleerd van de gevangen cellen en onderging twee rondes van T7-techniek gebaseerde lineaire amplificatie met behulp van Arcturus / Molecular Devices kits. De Experion LabChip (Bio-Rad) gel en electropherogram aangegeven van goede kwaliteit een (m) RNA, met een transcript lengte tot voorbij 600nt die nodig zijn voor microarrays. Het bedrag van het verkregen mRNA gemiddeld 51μg, met een aanvaardbare gemiddelde zuiverheid monster zoals aangegeven door de A260/280 verhouding van 2,5. Genexpressie werd geprofileerd met behulp van de Human X3P GeneChip probe array van Affymetrix. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">We beschrijven een proces met behulp van laser-capture microdissectie te isoleren en RNA uittreksel uit een homogene celpopulatie, piramidale neuronen, in laag III van de superieure temporale gyrus in postmortale de menselijke hersenen. We vervolgens lineair versterken (T7-based) mRNA, en hybridiseren het monster op de Affymetrix menselijke X3P microarray.</p>

Het verkrijgen van hoge kwaliteit-RNA van Single celpopulaties in Human postmortaal hersenweefsel

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Het verkrijgen van Eieren van Xenopus laevis Teven

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronale Kernen Isolatie van Human postmortaal hersenweefsel

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Een laser Capture microdissection protocol dat hoge kwaliteit RNA oplevert van vers-bevroren muis botten

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...