Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> בהכרת תודה אנו מודים התקנים מולקולריים בטכנולוגיות אנליטיות / ארקטורוס על התרומה הנדיבה של חומרים כימיים המשמשים למחקר. כמו כן, אנו מודים מרכז המשאבים הרווארד רקמות למתן רקמה אנושית המוות המוח <strong>מימון:.</strong> RO1MH76060 ו P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות החיים טכנולוגיות. </p>

<p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, אנו מנסים להתאים אישית את פרוטוקול לחלץ אוכלוסיות תאים הומוגנית מרקמת המוח הטרוגנית שלאחר המוות באמצעות XT ארקטורוס מערכת RNA הקשורות ערכות החילוץ. כפי שתואר לעיל, עשינו כמה שינויים הפרוטוקולים המקוריים המסופקים על ידי החברה, על מנת למקסם את שלמות RNA. לכידת מוצלח של תאים בודדים תלוי אך ורק על אופטימיזציה של צעדים לפני ללכוד מנת להשיג תאים לכל היותר עם RNA טוב. צעדים אלה כוללים את פרמטרים שונים הקשורים רקמות חתך ו מכתים. בקיצור, לגבי הכנת רקמות אלה כוללים: 1) להקטין את שיפוע הטמפרטורה כאשר חתך, 2) רק הצבת 2 סעיפים לכל שקופית, 3) ביצוע כל הצעדים התייבשות על הקרח, 4) להוסיף אינהיביטור RNase על הכתם, 5) הגדלת משך התייבשות אתנול 100% הסופית 3 דקות. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> באשר לכידת, אנו חשים כי השילוב של CapSure HS כובעים, עם התוכנה על הגדרת מאקרו, צריך להבטיח תוצאות אופטימליות. סביבת לחות מבוקרת הוא קריטי כדי ללכוד תאים בודדים, כמו לחות גבוהה מפחיתה באופן דרסטי רקמה &quot;להרים&quot;. טמפרטורות גבוהות עלולות גם להיות השפעה שלילית על איכות RNA. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הפרוטוקול בידוד RNA עם ערכת PicoPure, ישנם שני שלבים לשטוף. חשוב לבדוק כי כל חיץ לשטוף יוסר לפני העברת צינור אחר microcentrifuge עבור elution RNA, כמו נוכחות בכל המאגר במדגם הסופי שלך תגרום RNA מתחיל פחות הגברה. כדי להבטיח זאת, אנו צנטריפוגות לשטוף את הצעד הסופי של 2.5 דקות במקום 2 דקות כפי שהוצע בפרוטוקול סיפק. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוב, פרוטוקול הגברה ליניארית היה על פי הוראות היצרן. עם זאת, שתי נקודות מכריע צריך להילקח בחשבון בעת ​​שימוש בפרוטוקול זה: 1) לנסות להגביל הפסד של רנ&quot;א באמצעות העברת עודף של דגימות בין צינורות, רק באמצעות הצינורות 0.5ml בתנאי בשיתוף עם בלוק 0.5ml ב Cycler תרמית וכן 2) בעת העברת המדגם לעמודה טיהור לטיהור cDNA, כדי להיות בטוח ספין למטה דוגמיות לאחר ההעברה הראשונה. זה יגרום נוספת 1-2ul המדגם להוסיף עמודה הטיהור ולכן יכולים להגדיל את ההתאוששות cDNA. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עושים שימוש בערכה סוף תיוג TURBO עבור תיוג-ביוטין של דגימות מוגבל שלך ארנה, אנו מציעים הוספת μl כמה תוספת של מים לפני השלב צנטריפוגה, כדי להגדיל את התשואה RNA שכותרתו שחולצו מן הטור. דקה נוספת של צנטריפוגה יעזור גם בעניין זה, במיוחד אם אתה עובד עם רקמה מושפל, כגון רקמת FFPE. </p><p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מרגישים בטוחים כי פרוטוקול זה יאפשר למשתמש לבודד מבנים הומוגנית קטנה, כגון אוכלוסיות תא בודד, בתוך רקמת המוח הנתיחה שלאחר המוות הטרוגניים. פעולה זו מפחיתה תופעות דילול של מבנים הסמוכים ושאר סוגי תאים הנמצאים בשכבות שונות בתוך המוח, מוביל לתוצאות ממוקדות כלפי סוגי תאים מסוימים תחת חקירה. כמו איכות RNA המתקבל הוא מספיק טוב בשביל מחקרים microarray, אנו יכולים להתחיל להצביע חתימות מולקולריים ספציפיים של אוכלוסיות תאים ספציפיים מושפע המחלה מדינות. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p style=";text-align:right;direction:rtl"> הצענו לחקור את צמצום החומר האפור ברכס הרקתי מעולה לראות חולי סכיזופרניה, על ידי חקירת ביטוי גנים פרופילים של עצב פירמידליים בשכבה III. זה ידוע היטב כי קליפת המוח הוא מבנה הטרוגני במיוחד הכולל אזורים שונים, שכבות סוגי תאים, שכל אחד מהם מאופיין קומפוזיציות תאית ומולקולרית ברורים ולכן ההפרש ביטוי הגן פרופילים. כדי לעקוף את ההשפעות של בלבול ההטרוגניות רקמות, השתמשנו לייזר ללכוד microdissection (LCM) כדי לבודד תאים מסוג מסוים שלנו נוירונים כלומר פירמידה. </p><p style=";text-align:right;direction:rtl"> כ -500 עצב פירמידליים מוכתם הפתרון מכתים Histogene נלכדו באמצעות מערכת XT ארקטורוס LCM. RNA היה מבודד אז מתאי בשבי ועבר שני סיבובים של הגברה T7 מבוססי ליניארי באמצעות ארקטורוס / מולקולרית ערכות התקנים. LabChip Experion (Bio-Rad) ג&#39;ל ו electropherogram הצביעו באיכות טובה (מ &#39;) RNA, עם אורך התמליל הארכת 600nt בעבר נדרש microarrays. כמות ה-mRNA השיג ממוצעים 51μg, עם טוהר מקובל מדגם מתכוון כפי שעולה יחס A260/280, של 2.5. התבטאות גנים היה צדודית באמצעות מערך האדם X3P GeneChip בדיקה מ Affymetrix. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">אנו מתארים תהליך באמצעות לייזר ללכוד microdissection לבודד תמצית RNA מתוך אוכלוסייה הומוגנית תא, עצב פירמידליים, בשכבה III של gyrus הזמני מעולה במוח האנושי שלאחר המוות. לאחר מכן אנו להגביר באופן ליניארי (T7 מבוססי) mRNA, ועל להכליא את המדגם כדי האנושית Affymetrix X3P microarray.</p>

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

קבלת ביצים Xenopus laevis נקבות

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

תא בודד יניקה הקלטות של photoreceptors קון עכבר

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

הדור יציבה של hepatocyte דמויי תאים של אדם אוכלוסיות תאים גזע עובריים

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...