Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content"> हम कृतज्ञता आण्विक उपकरण उनके अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के उदार दान के लिए विश्लेषणात्मक प्रौद्योगिकियों / Arcturus को स्वीकार करते हैं. RO1MH76060 और P50MH080272: हम भी शवपरीक्षा मानव मस्तिष्क के ऊतकों प्रदान करने के लिए हार्वर्ड ऊतक संसाधन केंद्र <strong>अनुदान</strong> धन्यवाद.. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> इस वीडियो लेख के उत्पादन जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा प्रायोजित किया गया था. </p>

<p class="jove_content"> यहाँ, हम विषम शवपरीक्षा मस्तिष्क ऊतक Arcturus XT प्रणाली और संबंधित शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर से सजातीय सेल आबादियों को निकालने के लिए अनुकूलित करने के लिए एक प्रोटोकॉल करने का प्रयास. जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, हम कुछ संशोधनों के मूल कंपनी द्वारा उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल के लिए बनाया है, क्रम में आरएनए अखंडता को अधिकतम. एकल कक्षों के सफल कैप्चरिंग कदम पहले अनुकूलन पर कब्जा करने के लिए आदेश में अच्छा शाही सेना के साथ अधिकतम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पर पूरी तरह निर्भर करता है. इन चरणों विभिन्न सेक्शनिंग और धुंधला ऊतक के साथ जुड़े मानकों में शामिल हैं. संक्षेप में, ऊतक तैयारी के संबंध के साथ इन में शामिल हैं: 1) तापमान ढाल कम जब, 2 सेक्शनिंग) केवल स्लाइड प्रति 2 वर्गों, 3) रखने बर्फ पर सभी निर्जलीकरण कदम प्रदर्शन, 4) दाग 5, RNase अवरोध करनेवाला जोड़ने) बढ़ती अंतिम 100% 3 मिनट के लिए इथेनॉल में निर्जलीकरण की अवधि. </p><p class="jove_content"> के साथ संबंध है पर कब्जा करने के लिए, हमें लगता है कि मैक्रो सेटिंग पर सॉफ्टवेयर के साथ CapSure एचएस टोपियां, के संयोजन इष्टतम परिणाम यह सुनिश्चित करना चाहिए. नमी नियंत्रित वातावरण पर कब्जा एकल कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में उच्च आर्द्रता काफी ऊतक &quot;लिफ्ट&quot; कम कर देता है. उच्च तापमान भी शाही सेना गुणवत्ता पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है. </p><p class="jove_content"> PicoPure किट के साथ शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान, वहाँ दो धोने कदम उठाए हैं. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए जाँच लें कि सभी धोने बफर आरएनए elution के लिए दूसरे microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले हटा दिया जाता है, अपने अंतिम नमूना में बफर के किसी भी उपस्थिति के प्रवर्धन के लिए कम शुरू शाही सेना के रूप में परिणाम होगा. यह सुनिश्चित करने के लिए, हम 2.5 के बजाय मिनट से 2 मिनट के रूप में प्रदान की गई प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है के लिए अंतिम धोने कदम अपकेंद्रित्र. </p><p class="jove_content"> अधिकांश भाग के लिए, रैखिक प्रवर्धन प्रोटोकॉल के निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था. हालांकि, दो महत्वपूर्ण अंक खाते में लिया जाना चाहिए जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग: 1) ट्यूबों के बीच, केवल 0.5ml थर्मल cycler में एक 0.5ml ब्लॉक के साथ संयोजन के रूप में प्रदान की ट्यूबों का उपयोग करके नमूनों की अतिरिक्त स्थानांतरित माध्यम से शाही सेना के नुकसान को सीमित करने की कोशिश , और 2) जब सीडीएनए की शुद्धि के लिए शुद्धि स्तंभ के लिए नमूना हस्तांतरण, पहली स्थानांतरण के बाद नीचे नमूना ट्यूबों स्पिन करने के लिए सुनिश्चित हो. यह एक अतिरिक्त 1 शुद्धि स्तंभ जोड़ सकते हैं और इसलिए सीडीएनए वसूली में वृद्धि कर सकते हैं नमूना के 2ul में परिणाम देगा. </p><p class="jove_content"> जब टर्बो किट अंत लेबलिंग के बायोटिन अपने सीमित ARNA नमूनों की लेबलिंग के लिए इस्तेमाल कर रही है, हम बताते हैं एक अतिरिक्त कुछ μl जोड़ने centrifugation कदम से पहले पानी की है, को बढ़ाने के लिए लेबल शाही सेना स्तंभ से निकाले उपज. Centrifugation के एक अतिरिक्त मिनट भी इस संबंध में मदद करेंगे, खासकर अगर आप FFPE ऊतक के रूप में अपमानित ऊतक, के साथ काम कर रहे हैं. </p><p class="jove_content"> हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता heterogenous शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर एक सेल आबादी, जैसे छोटे सजातीय संरचना, को अलग करने के लिए सक्षम हो जाएगा लगता है. यह आसपास के ढांचे और अन्य सेल प्रकार मस्तिष्क के भीतर विभिन्न परतों में स्थित के कमजोर पड़ने प्रभाव, जांच के तहत विशेष सेल प्रकार की ओर लक्षित परिणामों के लिए अग्रणी को कम कर देता है. परिणामस्वरूप शाही सेना की गुणवत्ता के रूप में माइक्रोएरे अध्ययन के लिए काफी अच्छा है, हम विशेष सेल रोग राज्यों में प्रभावित आबादी के विशिष्ट आणविक हस्ताक्षर तुच्छ शुरू कर सकते हैं. </p>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> हम बेहतर अस्थायी गाइरस में एक प्रकार का पागलपन रोगियों में देखा ग्रे मामले में कमी की जांच परत III में जीन पिरामिड न्यूरॉन्स की अभिव्यक्ति प्रोफाइल पूछताछ द्वारा प्रस्ताव रखा. यह सर्वविदित है कि प्रमस्तिष्क प्रांतस्था एक असाधारण विविध क्षेत्रों, परतों और प्रकार की कोशिकाओं, जिनमें से प्रत्येक का अलग सेलुलर और आणविक रचनाओं और इसलिए अंतर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल द्वारा विशेषता है जिसमें विषम संरचना है. ऊतक विविधता के confounding प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, हम लेजर कब्जा microdissection (LCM) का इस्तेमाल किया है ताकि हमारे विशेष सेल प्रकार यानी पिरामिड न्यूरॉन्स को अलग. </p><p class="jove_content"> लगभग 500 पिरामिड Histogene धुंधला समाधान के साथ दाग न्यूरॉन्स Arcturus XT LCM प्रणाली का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. आरएनए तो कब्जा कर लिया कोशिकाओं से अलग किया गया था और T7 आधारित रैखिक प्रवर्धन Arcturus / आण्विक डिवाइसेज किट का उपयोग कर के दो राउंड लिया. Experion (जैव रेड) LabChip जेल और electropherogram अच्छी गुणवत्ता एक प्रतिलेख पिछले प्रोटीन के लिए आवश्यक 600nt विस्तार लंबाई के साथ एक शाही सेना (एम) ने संकेत दिया. प्राप्त mRNA की राशि 51μg औसत स्वीकार्य मतलब नमूना पवित्रता के साथ के रूप में 2.5 के A260/280 अनुपात, ने संकेत दिया है. जीन अभिव्यक्ति मानव Affymetrix से X3P GeneChip जांच सरणी का उपयोग profiled गया था. </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">हम एक लेजर कब्जा microdissection का उपयोग शाही सेना को अलग करने के लिए और एक सजातीय सेल की आबादी, शवपरीक्षा मानव दिमाग में बेहतर अस्थायी गाइरस की परत III में पिरामिड न्यूरॉन्स, से निकालने की प्रक्रिया का वर्णन. हम बाद में रैखिक mRNA (T7 आधारित) बढ़ाना, और Affymetrix मानव X3P माइक्रोएरे नमूना संकरण.</p>

मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों में एकल सेल आबादी से उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

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Xenopus laevis महिलाओं से अंडे प्राप्त करना

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

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मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों से neuronal नाभिक अलगाव

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

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माउस तंत्रिका ऊतक से सिंगल सेल निलंबन का सृजन

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Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

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मानव भ्रूण स्टेम सेल जनसंख्या से hepatocyte तरह प्रकोष्ठों के मजबूत पीढ़ी

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

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पूरे सेल आबादी में एकल कोशिका के स्तर पर Cyclin बी के proteolysis अध्ययन

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

उच्च throughput अनुक्रमण के लिए उच्च गुणवत्ता chromatin immunoprecipitation डीएनए टेम्पलेट की पीढ़ी (चिप seq)

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सेंडाइ वायरस के साथ मानव दैहिक कोशिकाओं से कुशल उत्पादन मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

एक लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन प्रोटोकॉल जो ताजा-फ्रोज़न माउस हड्डियों से उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदाकरता है

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

मानव मस्तिष्क ऊतक से प्रोटीन का एकाधिक प्रतिक्रिया निगरानी आधारित पता लगाने का उपयोग कर मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...