Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content">我々は感謝して分子デバイスの研究に使用される試薬の彼らの寛大な寄付のための分析技術/アルクトゥルスを認めます。我々はまた、死後、人間の脳組織を提供するためにハーバード大学の組織のリソースセンターに感謝<strong>資金</strong> ：。RO1MH76060とP50MH080272。 </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content">このビデオ記事の生産は、Life Technologies社が後援した。 </p>

<p class="jove_content">ここで、我々は、アルクトゥルスXTシステムと関連するRNA抽出キットを使用して異種の死後の脳組織から均質な細胞集団を抽出するためのプロトコルをカスタマイズしよう。上述のように、我々は、RNAの完全性を最大化するために、同社が提供するオリジナルプロトコルにいくつかの変更を行っている。単一細胞の正常なキャプチャリングは、単に良いRNAとの最大のセルを実現するために、キャプチャする前に手順を最適化に依存する。これらの手順は、組織の切片や染色に関連するさまざまなパラメータが含まれています。一言で言えば、組織の準備に関して、これらが含まれます：1）、2の切削時に温度勾配を減少）のみ4、氷の上のすべての脱水の手順を実行して、スライドごとに2セクション、3）を配置すること）の増加）染色、5のRNase阻害剤を追加する3分に最後の100％エタノールで脱水期間。 </p><p class="jove_content">キャプチャに関しては、我々はポイカプセルHSキャップの組み合わせと感じ、マクロの設定上のソフトウェアで、最適な結果を確認する必要があります。高湿度が大幅に組織&quot;リフト&quot;を減少させるように湿度制御環境は、単一細胞を捕捉するために重要です。高温はまた、RNAの品質に悪影響を与えることができる。 </p><p class="jove_content"> PicoPureキットでRNA分離プロトコール中に、2つの洗浄ステップがあります。すべての洗浄バッファーが最終的なサンプル中のバッファのいずれかが存在するが、増幅のための小さい開始RNAにつながるとして、RNA溶出のための別のマイクロ遠心チューブに移す前に削除されていることを確認することが重要です。これを確実にするために、我々は、提供するプロトコルで提案されている2.5分の代わりに2分間の最後の洗浄ステップを遠心してください。 </p><p class="jove_content">ほとんどの部分については、リニア増幅プロトコールは、製造元の指示に従ってでした。このプロトコルを使用するただし、次の2つの重要な点を考慮する必要があります：1）サーマルサイクラーで0.5ミリリットルのブロックと組み合わせて提供される唯一の0.5ミリリットルチューブを使用することにより、チューブ間のサンプルの過剰移籍を経由してRNAの損失を制限しようとする、および2）cDNAの精製のための精製カラムにサンプルを転送するとき、最初の転送の後にサンプルチューブをスピンダウンしてください。これは、精製カラムに追加するため、cDNAの回収を増加させることができるサンプルの追加1 - 2ulになります。 </p><p class="jove_content">あなたの限られたaRNAのサンプルのビオチン標識用ターボ末端標識キットを利用する場合、我々は余分な数μlを添加すると収率は、列から抽出された標識RNAを高めるために、遠心分離のステップの前に水から出ているとのこと。遠心分離の余分な分はあなたがそのようなFFPE組織などの劣化した組織、と作業している場合は特に、この点で役立ちます。 </p><p class="jove_content">我々は、このプロトコルは、異種の死後の脳組織内で、ユーザーがそのような単一の細胞集団としての小さな均質構造を、単離するために有効になると確信しています。これは、調査中の特定の細胞タイプをターゲットに結果につながる、脳内の様々な層に位置し、周囲の構造および他の細胞タイプの希釈効果を、減らすことができます。得られたRNAの質は、マイクロアレイ研究には十分なので、我々は、病気の状態に影響を受ける特定の細胞集団の特定の分子の署名を特定するために始めることができます。 </p>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content">我々は、レイヤーIIIの錐体細胞の遺伝子発現プロファイルを問い合わせることにより、統合失調症の患者に見られる上側頭回の灰白質の減少を調査することを提案した。それは、大脳皮質は多様な領域、層および別個の細胞および分子組成物およびそのための差動遺伝子発現プロファイルによって特徴づけられるそれぞれの細胞タイプを、構成する非常に不均質構造であることはよく知られています。組織の不均一性の交絡の影響を回避するために、我々は特定の細胞型、すなわち錐体細胞を単離するために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用。 </p><p class="jove_content"> Histogene染色液で染色された約500個の錐体細胞は、アルクトゥルスXT LCMシステムを使用して捕獲された。 RNAを捕捉細胞から単離され、アルクトゥルス/分子デバイスのキットを用いてT7ベースの線形増幅を2回施行した。 Experion LabChip（Bio - Rad社）ゲルや電気泳動図では、マイクロアレイに必要な過去の600ntを拡張する転写産物の長さで、良質の（m）のRNAを示した。得られたmRNAの量は2.5、A260/280比で示されるように許容可能な平均値サンプルの純度で、51μgの平均値。遺伝子発現は、アフィメトリクスからヒューマンX3PのGeneChipプローブアレイを用いてプロファイリングした。 </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">我々は、死後、人間の脳の上側頭回の層IIIの均質な細胞集団、錐体細胞からRNAを分離して抽出するためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用してプロセスを説明します。私たちは、その後直線的に（T7ベース）mRNAを増幅し、Affymetrix社人間X3Pマイクロアレイにサンプルをハイブリダイズする。</p>

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Research

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