Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content"> 우리는 기꺼이 그 연구에 사용되는 시약 그들의 관대한 기부에 대한 분자 디바이스에게 분석 기술 / 아크 투 르스을 인정합니다. 우리는 또한 사후 인간 뇌 조직을 제공하는 하버드 조직 리소스 센터 감사 <strong>기금</strong> :. RO1MH76060 및 P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> 이 비디오 문서의 생산은 생명 기술에 의해 후원되었다. </p>

<p class="jove_content"> 여기, 우리는 아크 투 르스 XT 시스템과 관련 RNA 추출 키트를 사용하여 이기종 사후 뇌 조직에서 균일한 세포 집단을 추출하는 프로토콜을 사용자 정의하려고 시도합니다. 위에서 설명한대로, 우리는 RNA의 무결성을 극대화하기 위해, 회사가 제공하는 원래의 프로토콜에 몇 가지 수정을 만들었습니다. 단일 세포의 성공적인 촬영은 전적으로 좋은 RNA와 함께 최대의 세포를 달성하기 위해 캡처하기 전에 단계를 최적화에 따라 달라집니다. 이 단계에서는 조직 sectioning 및 얼룩과 관련된 다양한 매개 변수를 포함합니다. 즉, 조직의 준비에 대해서는 이러한은 다음과 같습니다 1), 2 sectioning 때 온도 기울기를 감소) 만 4, 얼음의 모든 탈수 단계를 수행 슬라이드 당 2 섹션 3) 배치) 증가) 얼룩, 5 RNase 억제제를 추가 삼분로 최종 100 % 에탄올의 탈수 기간. </p><p class="jove_content"> 안부가 캡처하기 위해, 우리는 매크로 설정에서 소프트웨어와 CapSure HS 모자,의 조합이 최적의 결과를 보장한다고 생각합니다. 높은 습도는 크게 조직 &quot;엘리베이터&quot;를 감소 등 습도 제어 환경, 캡처 한 세포에 중요합니다. 고온 또한 RNA의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. </p><p class="jove_content"> PicoPure 키트와 RNA 격리 프로토콜 동안 두 세척 단계가 있습니다. 그것은 모든 씻어 버퍼가 RNA의 용출에 대한 다른 microcentrifuge 관에 전송하기 전에 제거 확인하는 최종 샘플에있는 버퍼의 존재로 증폭을위한 적은 시작 RNA가 발생합니다 중요합니다. 이것을 보장하기 위해, 우리는 제공된 프로토콜의 제안 2.5 분 대신에 2 분 동안 최종 세척 단계를 원심 분리기. </p><p class="jove_content"> 대부분의 경우, 선형 증폭 프로토콜은 제조 업체의 지시에 따라되었습니다. 이 프로토콜을 사용하면 단 두 개의 중요한 포인트를 고려해야한다 : 1) 튜브 사이의 온도 자전거 타는 사람에 0.5ml 블록과 함께 제공된에만 0.5ml 튜브를 사용하여 샘​​플을 초과하는 전송을 통해 RNA의 손실을 제한하려고 및 2) cDNA의 정화를위한 정화 열 샘플을 전송할 때, 첫 번째 전송 후 샘플 튜브를 스핀 다운해야합니다. 이것은 정화 열의에 추가하고 따라서 cDNA 복구를 향상시킬 수 있습니다 샘플의 추가 1 2ul집니다. </p><p class="jove_content"> 귀하의 제한 아르나 샘플 비오틴 - 라벨을위한 터보 최종 라벨링 키트를 이용하는 경우, 우리는 여분의 몇 μl를 추가하면 표시된 RNA가 열을 추출 수율 증가, 원심 분리 단계 전에 물을있어 좋습니다. 원심 분리의 추가 분 또한 같은 FFPE 조직과 같은 조직을 저하와 작업하는 특히,이 점에서 도움이 될 것입니다. </p><p class="jove_content"> 우리는이 프로토콜은 사용자가 이러한 불일치 사후 뇌 조직 내에 단세포 집단, 작은 균일한 구조를 분리 수 있도록 할 것이라 확신. 이 조사에서 특정 세포 유형으로 대상 결과로 이어지는 두뇌 내의 여러 레이어에 위치 주변의 구조와 다른 세포 타입의 희석 효과를 감소시킵니다. 결과 RNA의 품질이 microarray 연구에 대한 충분합니다, 우리는 질병 상태에 영향을 특정 세포 집단의 특정 분자 서명을 정확하게 시작할 수 있습니다. </p>

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> 우리는 레이어 III의 피라미드 뉴런의 유전자 발현 프로필을 심문하여 정신 분열증 환자에서 볼 뛰어난 시간적 이랑에있는 회색 물질 감소를 조사하기 위해 제안. 그것은 잘 대뇌 피질은 다양한 지역, 레이어와 독특한 세포와​​ 분자 작곡 따라서 차동 유전자 발현 프로파일이 특징입니다 각각의 세포 유형을 구성된 매우 이질적인 구조로되어 알려져있다. 조직 이질의 혼란함을 주죠 효과를 회피하기 위해, 우리는 특정 세포 유형 즉 피라미드 뉴런을 분리하기 위해 레이저 캡처 microdissection (LCM)을 사용합니다. </p><p class="jove_content"> Histogene의 얼룩 솔루션 물들일 약 500 피라미드 뉴런은 아크 투 르스 XT LCM 시스템을 사용하여 점령했다. RNA는 다음 캡처 세포로부터 격리 및 아크 투 르스 / 분자 장치 키트를 사용하여 T7 기반 선형 증폭의 두 라운드를 받았습니다했다. Experion LabChip (바이오 래드) 겔과 electropherogram은 microarrays에 필요한 과거 600nt를 확장 성적표 길이와 양질에게 (M) RNA를 지적했다. 2.5 A260/280 비율에 의해 표시로 얻은 mRNA의 양은 허용 의미 샘플 순도와 51μg 평균. 유전자 발현은 Affymetrix의 GeneChip 인간 X3P 프로브 어레이를 사용하여 프로파일되었습니다. </p>

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Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">우리는 사후에 인간의 두뇌에있는 우수한 시간적 이랑의 레이어 III에서 단일 세포 인구, 피라미드 뉴런에서 RNA를 분리하고 추출 레이저 캡처 microdissection를 사용하여 프로세스를 설명합니다. 우리는 이후 선형 (T7 기준) mRNA를 증폭하고, Affymetrix microarray 인간 X3P에 샘플을 잡종.</p>

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