Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content"> Мы выражаем глубокую признательность Molecular Devices Аналитические технологии / Арктур ​​за их щедрые пожертвования реагентов, используемых для исследования. Мы также благодарим ресурсов Гарвардского тканей центр для предоставления посмертных человеческих тканей мозга <strong>Финансирование:.</strong> RO1MH76060 и P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> Производство видео-статья была организована Life Technologies. </p>

<p class="jove_content"> Здесь мы пытаемся настроить протокол для извлечения однородной популяции клеток из разнородных тканей мозга посмертных использованием Арктур ​​XT системы и связанных с ними комплекты выделения РНК. Как отмечалось выше, мы сделали некоторые изменения в первоначальный протоколов, предоставляемых компанией, в целях максимизации РНК целостности. Успешный захват отдельных клеток зависит исключительно от оптимизации шагов до захвата в целях достижения максимальной клетки с хорошим РНК. Эти шаги включают в себя различные параметры, связанные с ткани срезов и окрашивание. Короче говоря, по отношению к ткани подготовки к ним относятся: 1) уменьшение градиента температур, когда секционирования, 2) только размещение 2 секции на слайд, 3) выполнение всех обезвоживания шаги на льду, 4) добавлением РНКазы ингибитора на пятно, 5) увеличение обезвоживания продолжительность в окончательном 100% этанола до 3 минут. </p><p class="jove_content"> Что касается захвата, мы считаем, что сочетание CapSure HS шапки, с помощью программного обеспечения на макро-настройки, должна обеспечивать оптимальные результаты. С контролируемой влажностью среды имеет решающее значение для захвата отдельных клеток, так как высокая влажность резко снижает ткани &quot;лифт&quot;. Высокая температура может также оказать негативное влияние на качество РНК. </p><p class="jove_content"> В протоколе РНК изоляции с комплектом PicoPure, Есть два этапа стирки. Важно убедиться, что все промывочного буфера удаляется прежде, чем перейти к другому микроцентрифужных трубка для элюции РНК, как и любое наличие буфера в конечный образец приведет к меньшему, начиная РНК для усиления. Чтобы обеспечить это, мы центрифуги последний шаг мыть в течение 2,5 минут, а не 2 минуты, как предлагается в протоколе предусмотрено. </p><p class="jove_content"> По большей части, линейного усиления протокол был в соответствии с инструкциями производителя. Тем не менее, два важных момента должны быть приняты во внимание при использовании этого протокола: 1) попытаться ограничить потери РНК с помощью избыточной передачи образцов между трубками, используя лишь 0,5 мл труб проводить в сочетании с 0,5 мл блока в термоциклер и 2) при передаче образца очистки колонки для очистки кДНК, убедитесь, что для замедления вращения пробирок с образцами после первой передачи. Это приведет к дополнительным 1-2UL образца, чтобы добавить к очистке колонку и, следовательно, может увеличить кДНК восстановления. </p><p class="jove_content"> Когда использованием TURBO конце маркировки комплект для биотин-маркировки ограниченной образцы Арна, мы предлагаем добавить несколько лишних мкл в воды перед центрифугированием шаг, чтобы увеличить выход меченой РНК извлекается из колонки. Дополнительная минута центрифугирования также поможет в этом отношении, особенно если вы работаете с деградированных ткани, такие как FFPE ткани. </p><p class="jove_content"> Мы уверены, что этот протокол позволит пользователю выделять небольшие однородные структуры, такие как единый клеточные популяции, в рамках гетерогенных посмертных тканей мозга. Это снижает эффект разбавления окружающих сооружений и других клеточных типов расположены в различных слоях в пределах мозга, что приводит к результатам направлены специфические типы клеток под следствием. Как качество получаемого РНК является достаточно хорошим для исследования микрочипов, мы можем начать определить конкретные молекулярные подписи конкретных популяций клеток при болезни пострадавших государств. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Мы предложили расследовать серый снижение вещества в верхней височной извилине видели у больных шизофренией, на допрос профили экспрессии генов пирамидных нейронов в слое III. Хорошо известно, что кора головного мозга является исключительно гетерогенной структуры, содержащей различных регионов, уровней и типов клеток, каждый из которых характеризуется определенными клеточные и молекулярные композиции и, следовательно, дифференциальное профили экспрессии генов. Чтобы обойти смешанных эффектов гетерогенности ткани, мы использовали лазер-захвата микродиссекции (LCM), чтобы изолировать наши конкретные камерного типа, т.е. пирамидных нейронов. </p><p class="jove_content"> Около 500 пирамидных нейронов окрашивали решение окрашивания Histogene были получены с помощью Арктур ​​XT LCM системы. РНК затем выделяют из захваченных клеток и прошли два раунда T7 основе линейного усиления использованием Арктур ​​/ Молекулярная комплектов устройств. Experion LabChip (Bio-Rad) гель и electropherogram указано хорошего качества (м) РНК, с расшифровкой длина расширения прошлом 600nt необходимых для микрочипов. Количество мРНК получены усредненные 51μg, с приемлемой средней чистоты образца, как указано A260/280 соотношение 2,5. Экспрессия генов был профилированный использованием прав X3P GeneChip зонд массив из Affymetrix. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Мы опишем процесс с использованием лазерного захвата микродиссекции, чтобы изолировать и экстракта РНК из однородной популяции клеток, пирамидных нейронов в слое III в верхней височной извилины в посмертных человеческий мозг. Впоследствии мы линейно усиливать (T7-основе) мРНК, и гибридизации образца Affymetrix человека X3P микрочипов.</p>

Получение высокого качества РНК от единичных клеточных популяций в тканях человека Мозг Посмертные

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Получение Яйца Xenopus laevis Женщины

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Изоляция нейронов ядра из человеческих тканей мозга Посмертные

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Генерация одноклеточных суспензий от мыши нервной ткани

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Прочная Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих эмбриональных стволовых клеток населения

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Эффективная генерация человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из человеческих соматических клеток с Сендай-вируса

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Лазерный захват Microdissection Протокол, который дает высокое качество РНК из свежезамороженных костей мыши

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Рабочий процесс количественной протеомики с использованием множественного мониторинга реакций на основе обнаружения белков из ткани мозга человека

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...