Name: obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue
Uploaded: 2009-08-06T19:00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

<p class="jove_content"> Vi erkänner tacksamt Molecular Devices Analytisk teknik / Arcturus för deras generösa donation av reagenser som används för studien. Vi tackar också Harvard Center Tissue resurs för att ge obduktion mänsklig hjärnvävnad <strong>Finansiering:.</strong> RO1MH76060 och P50MH080272. </p>

<ol>
	<li>Imbeaud, S., Graudens, E., Boulanger, V., Barlet, X., Zaborski, P., Eveno, E., Mueleer, O., Schroeder, A., Auffray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+standardization+of+RNA+quality+assessment+using+user-independent+classifiers+of+microcapillary+electrophoresis+traces.">Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.</a> <em style='font-style: italic'>Nucleic Acids Res</em>. <b>33</b>, e56-e56 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"> Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av Life Technologies. </p>

<p class="jove_content"> Här försöker vi att skräddarsy ett protokoll för att extrahera homogena cellpopulationer från heterogena obduktion hjärnvävnad med hjälp av Arcturus XT-systemet och relaterade RNA-kit extraktion. Som beskrivits ovan har vi gjort en del ändringar i de ursprungliga protokollen från företaget, för att maximera RNA integritet. Den framgångsrika upptagningen av enskilda celler beror enbart på att optimera de steg före att fånga för att uppnå maximal celler med gott RNA. Dessa åtgärder inkluderar de olika parametrarna i samband med vävnaden snittning och färgning. Kort sagt, när det gäller vävnad förberedelse dessa inkluderar: 1) minskar temperaturgradienten vid snittning, 2) bara placera två sektioner per bild, 3) kan utföra alla uttorkning steg på is, 4) att lägga RNas Inhibitor till fläcken, 5) ökar av uttorkning varaktighet i den slutliga 100% etanol till 3 minuter. </p><p class="jove_content"> När det gäller att fånga upp, känner vi att kombinationen av CapSure HS mössor, med programvaran på Macro inställningen bör för bästa resultat. En fukt-kontrollerad miljö är avgörande för att fånga enskilda celler, som hög luftfuktighet drastiskt minskar vävnad &quot;lyft&quot;. Höga temperaturer kan också ha en negativ effekt på RNA kvalitet. </p><p class="jove_content"> Under RNA isolering protokollet med PicoPure kit, det finns två tvättar steg. Det är viktigt att kontrollera att alla tvättbuffert tas bort innan de överförs till en annan mikrocentrifugrör för RNA eluering, som någon närvaro av bufferten i din slutliga urvalet kommer att resultera i färre start RNA för förstärkning. För att säkerställa detta, centrifugera vi den sista tvätten steget för 2,5 minuter i stället för 2 minuter som föreslås i det medföljande protokollet. </p><p class="jove_content"> För det mesta var linjär förstärkning protokollet enligt tillverkarens anvisningar. Bör dock två viktiga punkter bör beaktas vid användning av detta protokoll: 1) Försök att begränsa förlusten av RNA via överskott överföring av prover mellan rören genom att använda enbart 0,5 ml rören lämnas i samband med ett 0,5 ml block i termocykeln och 2) när du överför provet till rening kolumnen för rening av cDNA, se till att spinna ner i provrören efter den första överföringen. Detta kommer att resultera i ytterligare en 1-2ul av provet för att lägga till rening kolumnen och därför kan öka cDNA återhämtning. </p><p class="jove_content"> Vid användning av TURBO end-märkning kit för biotin-märkning av din begränsade ARNA prover, föreslår vi att lägga till en extra några l s vatten innan centrifugering steg för att öka de märkta RNA avkastningen ur kolonnen. En extra minut av centrifugering kommer också att bidra i detta avseende, särskilt om du arbetar med trasiga vävnad, såsom FFPE vävnad. </p><p class="jove_content"> Vi är övertygade att detta protokoll gör det möjligt för användaren att isolera små homogena strukturer, såsom enda cell populationer inom heterogena obduktion hjärnvävnad. Detta minskar utspädningseffekter av omgivande strukturer och andra cell-typer som finns i de olika lagren i hjärnan, vilket leder till resultat riktade mot specifika celltyper under utredning. Eftersom kvaliteten på den resulterande RNA är bra nog för microarray studier, kan vi börja sätta fingret på specifika molekylära signaturer av specifika cellpopulationer påverkas sjukdomstillstånd. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4.5&#x201D; Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>82027-392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Arcturus XT&trade; Laser-Capture Microdissection (LCM) System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>13821-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&trade; HS LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CapSure&reg; Macro LCM Caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0211</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; Automated Electrophoresis Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA HighSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7155</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA HighSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7156</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&#x2122; RNA StdSens Chips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7153</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Experion&trade; RNA StdSens Reagents</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>700-7154</td>
<td>10 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Falcon&reg;  polypropylene Conical tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton-Dickinson Labware</td>
<td>352070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneAmp&reg; thin-walled reaction tube with domed cap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>N8010611</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GeneChip&reg; Human X3P array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Affymetrix</td>
<td>900516</td>
<td>6 chips</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&reg; LCM Frozen Section Staining kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0401</td>
<td>For staining solution, jars, ethanols and Xylene</td>
</tr>
<tr>
<td>Histogene&trade; LCM slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>12231-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro Slide Box</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48444-004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microm HM 505E cryostat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>22-050-350</td>
<td>Catalogue number for similar product as current product no longer available</td>
</tr>
<tr>
<td>Microprocessor Controlled 280 series Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electron Corporation</td>
<td>51221048</td>
<td>Model 282</td>
</tr>
<tr>
<td>Molecular Sieve</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD&trade;</td>
<td>MX1583L-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>n/a</td>
<td>The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.</td>
</tr>
<tr>
<td>Nuclease-free water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9932</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEN Membrane glass slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>LCM 0522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PicoPure&reg; RNA Isolation kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0204</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RiboAmp&reg;HS<sup>PLUS</sup> with Biotin labeling</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MDS Analytical Technologies</td>
<td>KIT0511B</td>
<td>12 reactions Includes TURBO biotin labeling&trade; kit</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap&reg;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion&reg;</td>
<td>AM9780/2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNasin&reg; Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N261B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&trade; III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18080-044</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

obtaining high quality rna from single cell populations in human postmortem brain tissue

<p class="jove_content"> Vi föreslog att undersöka den grå massan minskning av superior temporal gyrus ses i schizofrenipatienter, genom att förhöra genuttrycksprofilerna av pyramidformade nervceller i skikt III. Det är väl känt att hjärnbarken är en ovanligt heterogen struktur med olika regioner, lager och celltyper, som alla kännetecknas av distinkt cellulära och molekylära sammansättningar och därför differential gen profiler uttryck. Kringgå förbryllande effekter av vävnad heterogenitet använde vi laser capture microdissection (LCM) i syfte att isolera våra specifika cell-typ, dvs pyramidala nervceller. </p><p class="jove_content"> Cirka 500 pyramidala nervceller färgats med Histogene färglösningen fångades med hjälp av Arcturus XT LCM-system. RNA var då isolerat från fångas celler och genomgick två omgångar av T7-baserade linjär förstärkning med Arcturus / Molecular Devices kit. Den Experion LabChip (Bio-Rad) gel och electropherogram visade god kvalitet ett (m) RNA, med en avskrift längd sträcker sig förbi 600nt krävs för mikroarrayer. Mängden erhållna mRNA genomsnitt 51μg med godtagbart genomsnittligt urval renhet som anges av A260/280 förhållandet, på 2,5. Gene expression var profilerade med mänskliga X3P GeneChip sond samling från Affymetrix. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

<p class="jove_content">Vi beskriver en process med laser capture microdissection att isolera och extrahera RNA från en homogen cellpopulation, pyramidala nervceller i lager III i superior temporal gyrus i döden mänskliga hjärnor. Vi därefter linjärt förstärker (T7-baserat) mRNA, och hybridisera provet till Affymetrix mänskliga X3P microarray.</p>

Erhålla hög kvalitet RNA från Single cellpopulationer i Human obduktion hjärnvävnad

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Skaffa Ägg från Xenopus laevis Kvinnor

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neuronal Nuclei Isolering från Human obduktion hjärnvävnad

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generering av encelliga Suspensioner från mus nervvävnad

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Encelliga Sug Inspelningar från fotoreceptorer Mus Cone

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Av hög kvalitet om Kromatin Immunoprecipitation DNA Mall för hög genomströmning sekvensering (chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Human inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

En laser Capture Microdissection protokoll som ger hög kvalitet RNA från färsk frysta mus ben

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

Kvantitativt proteomikarbetsflöde med hjälp av flera reaktionsövervakningsbaserade detektion av proteiner från mänsklig hjärnvävnad

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...