Name: method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00
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Die Arbeit wurde durch die NIH gewährt AI57159 (SCH) und AI72346 (bis AMvO) unterstützt. SCH ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Deckglas Funktionalisierung Die planare Doppelschicht in der Fusion-Assay verwendet wird, auf eine hydratisierte Film von Dextran unterstützt. Dextran dient als Abstandshalter zwischen den planaren Bilayer und Glasoberfläche. Dies verhindert Membran-Komponenten erst gar nicht auf der Glasoberfläche fest und bietet auch Raum in dem die Inhalte einer Virus-Partikel können auf Fusion zu entkommen. Deckgläser werden durch Behandlung mit einem Epoxysilan, die uns chemisch binden Dextran, das G...

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	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Vorbereitung von Flüssigkeit und kontinuierliche Lipiddoppelschichten kann schwierig sein. Spuren von Verunreinigung materieller oder Oberflächenfehler verhindert Ausbreitung von Doppelschichten. Eine sorgfältige Reinigung und Abscheidung einer gleichmäßigen Schicht von Dextran sind unerlässlich. Längerer Abbildung von Viruspartikeln können Bleichmittel der fluoreszierenden Markierungen oder diese wieder inaktiviert. Photo-Schäden dieser Art ist auch in der Bio-Imaging und Einzelmol...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Membranfusion ist ein wesentlicher Schritt bei der Eingabe von umhüllten Viren in die Zellen. Konventionelle Fusion-Assays in der Regel über eine große Anzahl von Fusion Events, so dass es schwierig quantitativ zu analysieren die Reihenfolge der molekularen Schritte. Wir haben eine in vitro entwickelt, zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay zur Kinetik der einzelnen Viruspartikel Verschmelzung mit einer Ziel-Doppelschicht auf einer im Wesentlichen Flüssigkeit Unterstützung zu überwachen. Influenza Virus-Partikel sind mit einem grünen lipophilen Fluorophor an die Membran und eine rote hydrophilen Fluorophor an die virale Innenraum Fleck Fleck inkubiert. Wir deponieren ein Gangliosid-haltigen Lipid-Doppelschicht auf der Dextran-funktionalisierten Glasoberfläche einer Durchflusszelle, bebrüten die Viruspartikel auf der planaren Bilayer und Bild der Fluoreszenz einer 100 x 100 pm 2-Gebiet, mit mehreren hundert Partikel, auf einem CCD Kamera. Durch die Abbildung die rote und grüne Fluoreszenz können wir gleichzeitig überwachen das Verhalten der Membran-Farbstoff (grün) und der wässrigen Inhalt (rot) der Partikel. Beim Absenken des pH auf einen Wert unterhalb der Fusion pH-Wert, werden die Partikel mit der Membran verschmelzen. Hemifusion, die Verschmelzung der äußeren Blatt der viralen Membran mit dem äußeren Blatt der Zielmembran, wird sichtbar, wie eine plötzliche Veränderung in der grünen Fluoreszenz eines Teilchens. Bei der anschließenden Fusion der beiden verbleibenden distalen Flugblättern eine Pore wird gebildet werden und die rot-emittierenden Fluorophors in der Viruspartikel wird unter dem Zielmembran freigegeben werden. Diese Veranstaltung wird zu einer Abnahme der roten Fluoreszenz der einzelnen Teilchen. Schließlich berichtet der integrierten Fluoreszenz aus einer pH-sensitiven Fluorophor, dass in der Ziel-Membran eingebettet ist auf den genauen Zeitpunkt der pH-Abfall. Von den drei Fluoreszenz-time Spuren lassen sich alle wichtigen Ereignisse (pH-Abfall-, Lipid-Mischung auf hemifusion, Content-Mischen nach Porenbildung) jetzt auf einfache Weise und für jedes Teilchen einzeln entnommen werden. Durch das Sammeln der verstrichenen Zeit für die verschiedenen Übergänge für viele einzelne Partikel in Histogramme, können wir die Lebensdauer der entsprechenden Zwischenprodukte. Auch versteckte Zwischenprodukte, die nicht über eine direkte Fluoreszenz beobachtbar können direkt visualisiert werden aus diesen Histogrammen.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Wir präsentieren einen<em&gt; In vitro,</em&gt; Zwei-Farben-Fluoreszenz-Assay auf die Fusion einzelner Viruspartikel mit einer Flüssigkeit Ziel Doppelschicht zu visualisieren. Durch die Kennzeichnung Viruspartikel mit Fluorophoren, die unterschiedlich Fleck der viralen Membran und im Inneren sind wir in der Lage, die Kinetik der hemifusion und Porenbildung zu überwachen.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single Particle Electron Microscopy Rekonstruktion der Exosom Complex Mit der Random-konische Tilt-Methode

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Forschung

Biologie

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studieren Proteolyse von Cyclin B an der Single Cell Level in Whole Cell Populationen

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Analyse von LINE-1-Retrotransposition im Einzel Nucleus Ebene

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Analyse der Beta-Zellfunktion mit einzelligen Auflösung Kalzium Imaging im Zebrafisch Inselchen

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...