Name: method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

העבודה נתמכה על ידי NIH מענקים AI57159 (עד SCH) ו AI72346 (עד AMvO). SCH הוא הווארד יוז חוקר רפואי במכון.

להחליק זכוכית לכסות functionalization Bilayer מישוריים המשמשים assay היתוך נתמך על סרט hydrated של dextran. Dextran מעשים כשומר רווח בין bilayer מישוריים משטח זכוכית. זה מונע מרכיבי קרום מלהיות תקוע על משטח זכוכית מספק גם מקום שבו התוכן של חלקיק וירוס יכול להי...

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

הכנת נוזל רציפה bilayers השומנים נתמך יכול להיות מאתגר. כמויות זעירות של חומר מזהם פגמים או משטח תמנע הפצת bilayers. בתצהיר ניקוי זהיר של שכבה אחידה של dextran חיוניים. הדמיה ממושכת של חלקיקי הנגיף יכול להלבין את תוויות ניאון או לגרום להם להי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

היתוך ממברנה היא מהווה נדבך חיוני במהלך כניסה של וירוסים עטופים לתוך התאים. מבחני היתוך קונבנציונלי בדרך כלל לדווח על מספר רב של אירועים היתוך, ולכן קשה לנתח באופן כמותי את רצף הפעולות המולקולריים המעורבים. פיתחנו במבחנה, שני צבעים assay הקרינה לפקח קינטיקה של פיוזינג חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד על תמיכה נוזל בעיקרו. חלקיקים שפעת נגיפית מודגרת עם fluorophore lipophilic ירוק להכתים את הממברנה fluorophore הידרופילי אדום להכתים את פנים ויראלי. אנו פיקדון bilayer ganglioside המכילים שומנים על פני השטח dextran-functionilized הזכוכית של התא זרימה, דגירה חלקיקים נגיפיים על bilayer את התמונה מישוריים את הקרינה של 100 x 100 מיקרומטר אזור 2, המכיל כמה מאות של חלקיקים, על CCD המצלמה. על ידי הדמיה הן פלואורסצנטי אדום וירוק, אנחנו יכולים בו זמנית לפקח על התנהגותם של לצבוע את הממברנה (ירוק) לבין תוכן מימית (אדום) של חלקיקים. לאחר הפחתת ה-pH מתחת לערך pH המיזוג, חלקיקים יהיה הפתיל עם הממברנה. Hemifusion, מיזוג של עלון החיצוני של קרום ויראלי עם עלון החיצוני של קרום היעד, יהיה גלוי כשינוי פתאומי פלואורסצנטי ירוק של חלקיק. עם היתוך הבאים של שני כרוזים דיסטלי הנותרים נקבוביות תוקם ואת fluorophore אדום פולטות חלקיק נגיפי ישוחררו תחת קרום היעד. אירוע זה יהיה להצמיח ירידה של הקרינה האדום של חלקיקים בודדים. לבסוף, פלואורסצנציה משולב מ fluorophore pH רגיש המוטבע קרום היעד מדווחת על הזמן המדויק של ירידה ה-pH. מתוך שלושת זמן פלואורסצנציה-עקבות, את כל האירועים החשובים (ירידה pH, שומנים ערבוב על תוכן hemifusion, ערבוב על היווצרות נקבוביות) כעת ניתן לחלץ בצורה ישירה עבור כל חלקיק בנפרד. על ידי איסוף פעמים שחלף על מעברים שונים עבור חלקיקים בודדים רבים היסטוגרמות, אנו יכולים לקבוע את תקופות חיים של ביניים המקביל. אפילו ביניים נסתרים אין הנצפה פלורסנט ישיר ניתן דמיינו ישירות היסטוגרמות אלו.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

אנו מציגים<em&gt; במבחנה,</em&gt; שני צבעים assay הקרינה לדמיין את היתוך של חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד נוזל. על ידי תיוג חלקיקים נגיפיים עם fluorophores כי דיפרנציאלי כתם הממברנה ויראלי הפנים שלה, אנו יכולים לפקח על קינטיקה של hemifusion היווצרות נקבוביות.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...