Name: method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00
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작품은 NIH 교부금 AI57159 (SCH)을하고 AI72346 (AMvO)을 지원했다. SCH는 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다.

유리 커버 슬립 작용화 퓨전 분석에 사용되는 평면 이중층은 dextran의 수산화 필름에서 지원됩니다. Dextran은 평면 이중층과 유리 표면 사이에 스페이서 역할을합니다. 이것은 유리 표면에 붙어되는 것을 막 구성 요소를 방지할 수 있으며 바이러스 입자의 내용이 융합시 탈출 수있는에 공간을 제공합니다. 유리 coverslips 우리가 화학적으로 결합 dextran에 유리 (Elender, 외. 199...

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	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

유체 및 지속적인 지원 지질 bilayers의 준비 도전하실 수 있습니다. 물질 또는 표면 결함을 오염 미량의은 bilayers의 확산 방지합니다. dextran의 유니폼 레이어주의 청소와 증언이 필수적입니다. 바이러스 입자의 장시간 영상 표백제 형광 라벨을하거나 그들이 inactivated 될 발생할 수 있습니다. 이런 종류의 사진 손상이 잘 바이오 이미징 및 단일 분자 분야에 알려져 있고, 일반적?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

막 융합이 세포로 싸여 바이러스의 항목 중에 필수적인 단계입니다. 기존의 퓨전 assays은 일반적으로 어려운 것인 관련된 분자 단계의 순서를 분석하고, 퓨전 이벤트의 다수에 대한 리포트입니다. 우리는 체외에서 본질적으로 유동적인 지원 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합의 속도론을 모니터하는 두 색 형광 분석을을 개발했습니다. 인플루엔자 바이러스 입자는 멤브레인 및 바이러스 인테리어를 얼룩이 빨간색 친수성 ​​형광단를 얼룩이 녹색 lipophilic 형광단와 incubated 있습니다. 우리는 흐름 세포의 dextran - functionilized 유리 표면에 ganglioside 함유 지질 이중층을 입금, CCD의 입자의 수백을 포함, 평면 이중층 및 이미지 100 X 100 μm의 두 영역의 형광에 바이러스 입자를 품어 카메라. 이미징 모두 빨간색과 녹색 형광함으로써, 우리는 동시에 막 색소 (녹색) 및 입자의 수​​성 내용 (빨간색)의 동작을 모니터링할 수 있습니다. 퓨전 산도 아래 값을 산도를 낮출되면 입자는 세포막과 융합됩니다. Hemifusion은 대상 막의 바깥쪽 전단지와 입소문 막의 바깥 전단지의 병합, 입자의 녹색 형광의 갑작스런 변화로 볼 수 있습니다. 남은 두 말초 전단지의 후속 융합되면 기공이 형성되고 바이러스 입자의 빨간 발광 형광단은 대상 막에 따라 공개됩니다. 이 행사는 개별 입자의 붉은 형광의 감소로 상승을 제공합니다. 마지막으로, 대상 막에 포함된 산도에 민감한 형광단에서 통합 형광이 산도 드롭의 정확한 시간에보고합니다. 세 형광 시간의 흔적에서 모든 중요한 이벤트 (산도 드롭, 기공 형성에 혼합 hemifusion, 컨텐츠에 따라 혼합 지질)는 이제 간단한 방법으로 개별적으로 모든 입자에 대한 추출하실 수 있습니다. histograms에 많은 개별적인 입자에 대한 다양한 변환에 대한 경과 시간을 수집하여, 우리는 해당 중간체의 수명을 결정할 수 있습니다. 직접 형광 관찰가 없어도 숨겨진 중간체는 이러한 histograms에서 직접 시각하실 수 있습니다.

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

우리는을 제시<em&gt; 체외에</em&gt; 두 컬러 유체 대상 이중층 단일 바이러스 입자의 융합을 시각화하기 위해 형광 분석. differentially 바이러스 멤브레인 및 인테리어 얼룩 fluorophores와 바이러스 입자를 분류함으로써, 우리는 hemifusion과 기공 형성 속도론을 모니터 할 수 있습니다.

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

연구

생물학

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

포유 동물 세포에서 헴 합성 레벨 측정

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...