Name: method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

O trabalho foi suportado pelo NIH concede AI57159 (para SCH) e AI72346 (para AMvO). SCH é um Howard Hughes Medical Institute.

Funcionalização lamínula de vidro A bicamada planar utilizada no ensaio de fusão é apoiada em um filme hidratado de dextran. Dextran atua como um espaçador entre a bicamada planar e superfície de vidro. Isso evita que componentes da membrana de tornar-se preso na superfície do vidro e também fornece espaço para que o conteúdo de uma partícula do vírus pode escapar após a fusão. Lamínulas de vidro são funcionalizados através de tratamento com um epóxi silano, o que nos permit...

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Preparação de fluido e contínuo bicamadas lipídicas suportados pode ser um desafio. Traços de contaminação defeitos de material ou superfície vai evitar a propagação de bicamadas. Limpeza cuidadosa e deposição de uma camada uniforme de dextran são essenciais. Imagem prolongada de partículas do vírus podem lixívia as etiquetas fluorescentes ou levá-los a tornar-se desativado. Foto-dano deste tipo é bem conhecido na bio-imagem e campos única molécula e é acreditado geralme...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Fusão de membrana é um passo essencial durante a entrada de vírus encapsulados dentro das células. Ensaios de fusão convencionais tipicamente relatório sobre um grande número de eventos de fusão, tornando-se difícil analisar quantitativamente a seqüência de passos moleculares envolvidos. Nós desenvolvemos uma in vitro, duas cores-ensaio de fluorescência para monitorar cinética de fusão única partículas do vírus com uma bicamada destino em um apoio essencialmente fluido. Partículas de gripe viral são incubados com um fluoróforo verde lipofílico para manchar a membrana e um fluoróforo vermelho hidrofílico para manchar o interior viral. Nós depositamos uma bicamada lipídica contendo gangliosídeo na superfície do vidro dextran-functionilized de uma célula de fluxo, incubar as partículas virais na bicamada planar e imagem da fluorescência de 100 x 100 mm 2 de área, contendo várias centenas de partículas, em um CCD câmera. Por imagem tanto a fluorescência vermelha e verde, podemos monitorar simultaneamente o comportamento do corante de membrana (verde) e do conteúdo aquoso (vermelho) das partículas. Após a redução do pH para um valor abaixo do pH de fusão, as partículas irão fundir com a membrana. Hemifusão, a fusão do folheto externo da membrana viral com o folheto externo da membrana-alvo, será visível como uma mudança súbita na fluorescência verde de uma partícula. Após a fusão subseqüente dos dois restantes folhetos distal de um poro será formado eo fluoróforo vermelho-emitting na partícula viral será lançado sob a membrana alvo. Este evento dará origem a uma diminuição da fluorescência vermelha de partículas individuais. Finalmente, a fluorescência integrada a partir de um fluoróforo pH-sensíveis que está incorporado na membrana-alvo relatórios sobre o momento exato da queda de pH. Do três-tempo de fluorescência traços, todos os eventos importantes (queda de pH, lipídios mistura no conteúdo hemifusão, misturando sobre a formação de poros) podem agora ser extraídas de uma maneira direta e para cada partícula individualmente. Coletando os tempos decorridos para várias transições para muitas partículas individuais em histogramas, podemos determinar a vida útil dos intermediários correspondentes. Mesmo intermediários ocultos que não têm um observáveis ​​direta fluorescentes podem ser visualizados directamente a partir destes histogramas.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Nós apresentamos um<em&gt; In vitro,</em&gt; Duas cores-ensaio de fluorescência para visualizar a fusão de partículas do vírus de solteiro com uma bicamada alvo fluido. Ao classificar partículas virais com fluoróforos que diferencialmente mancha a membrana viral e no seu interior, somos capazes de monitorar a cinética de hemifusão e formação de poros.

Método para Medição da Cinética de Fusão Viral no Nível única partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Única partícula Reconstrução Microscopia Eletrônica do Complexo exossomo Usando o método Tilt Aleatório Conical

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Medição dos Níveis de heme em células de mamíferos Síntese

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Análise de LINE-1 retrotransposição no Núcleo de nível único

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Administração simples e eficaz e visualização de micropartículas no sistema circulatório de peixes pequenos usando injeção de rim

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Análise da função de células Beta utilizando imagens de cálcio de célula única resolução em ilhotas de Zebrafish

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...