Name: method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Работа выполнена при поддержке грантов NIH AI57159 (для СЧ) и AI72346 (для AMvO). SCH является Медицинского института Говарда Хьюза следователь.

Стеклянная крышка скольжения функционализации Плоский бислой, используемых в анализе слияния поддерживается на гидратированных фильм декстрана. Декстран выступает в качестве прокладки между плоскими бислоя и стеклянные поверхности. Это предотвращает мембранных комп...

<ol>
	<li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalisation+of+Si/SiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers.">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li><li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion.">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li></ol>

Подготовка жидкости и непрерывного поддерживается бислоев липидного может оказаться непростой задачей. Следовые количества загрязняющих материалов или дефекты поверхности будут препятствовать распространению бислоев. Тщательная очистка и осаждение равномерным слоем декстран име...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Corning cover glass squares, 25 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS286525</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>8542E40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gelest</td>
<td>SIG5840.1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran T-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacosmos</td>
<td>5510 0500 4006</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>850457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cholesterol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>700000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B1616</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin, fluorescein conjugate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S-869</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disialoganglioside GD1a from bovine brain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2392</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Extruder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Avanti</td>
<td>610000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 micron polycarbonate membrane filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>800309</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 mm drain discs (membrane supports)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>230300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sulforhodamine b sodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>S1402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>See Floyd et al. 2008 for synthesis protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>PD-10 desalting columns</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-0851-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nikon fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>TE2000-U</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coherent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702213</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for measurement of viral fusion kinetics at the single particle level

Мембранные слияние является важным шагом в процессе вступления оболочечных вирусов в клетки. Обычные анализы слияние обычно сообщают о большом числе слияние событий, что делает ее трудно количественно проанализировать последовательность молекулярной этапов. Мы разработали в пробирке, двухцветные флуоресценцию ряда анализов для мониторинга кинетики одного слияние вирусных частиц с мишенью на двухслойной жидкости существенно поддержки. Грипп вирусных частиц инкубируют с зеленым липофильных флуорофора запятнать мембраны и красные гидрофильные флуорофора запятнать вирусных интерьера. Мы депозита ганглиозида содержащих липидного бислоя на декстран-functionilized стеклянной поверхности проточной ячейки, инкубировать вирусных частиц на плоских двухслойных и изображения флуоресценции 100 х 100 мкм 2 области, содержащей несколько сотен частиц, на ПЗС камеры. По изображения как красный и зеленый флуоресценции, мы можем одновременно контролировать поведение мембраны красителя (зеленый) и водный контента (красный) частиц. После снижения рН до значения ниже слияния рН, частицы сливаются с мембраной. Hemifusion, слияние внешнего листовку вирусной мембраны с внешней листовка целевой мембраны, будет видно, как внезапное изменение в зеленой флуоресценции частицы. После последующего слияния двух остающихся дистальных листовки пор будет сформирован и красно-излучающих флуорофора в вирусные частицы будет выпущен под целевой мембраны. Это событие приведет к снижению красной флуоресценции отдельных частиц. Наконец, интегрированная флуоресценции рН-чувствительных флуорофора, внедренного в целевой мембраны отчеты о точном времени рН капли. Из трех флуоресценцию времени следы, все важные события (рН капли, липидный смешивания на hemifusion, содержание смешивания на порообразования) теперь могут быть извлечены в прямой манере и для каждой частицы в отдельности. Собирая прошедшее время для различных переходов для многих отдельных частиц в гистограммы, можно определить время жизни соответствующих промежуточных продуктов. Даже скрытые промежуточные, которые не имеют прямого флуоресцентного наблюдаемые могут быть визуализированы непосредственно из этих гистограмм.

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level at JoVE.com

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Мы представляем<em&gt; В пробирке,</em&gt; Двухцветного анализа флуоресценции для визуализации слияние одиночных частиц вируса с двухслойной жидкости цели. Называя вирусных частиц с флуорофоров, что дифференциально пятно вирусной оболочки и ее интерьер, мы имеем возможность отслеживать кинетику hemifusion и образования пор.

Метод измерения Вирусный Кинетика Fusion на одном уровне частиц

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Одной частицы электронной микроскопии Реконструкция комплекса Exosome Использование случайных Коническая Метод Tilt

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

Измерение кинетики мРНК Транскрипция в одиночных камерах Жизнь

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Измерение уровней Гем синтез в клетках млекопитающих

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Анализ LINE-1 ретротранспозиции на уровне одного ядра

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Передовые методы Confocal микроскопии для изучения кинетики в повреждения ДНК и белок белковых взаимодействий

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Анализ функции бета клеток с использованием одной ячейки резолюции кальция визуализации в Zebrafish островков

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...