Name: depletion of specific cell populations by complement depletion
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion at JoVE.com

وأود أن أشكر Sreemanti باسو لتقديم البيانات عن الشكل 1. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح AI069358 ومؤسسة البحوث BloodCenter.

ألف أرنب المتممة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تكمل الأسهم إذابة أرنب في درجة حرارة الغرفة ، وبعد ذلك في aliquoted 0.5 و / أو وحدات التخزين 1 مل -20-80 والمجمدة في درجة مئوية لمدة طويلة الأجل للتخزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي لكل معاير الكثير من تكملة لتحديد تركيز العمل الأمثل. عادة ، والتخفيف من 1:10 حتي 1:20 هو الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يكمل الأرنب presterilized دائما قبل بيعها ، اعتمادا على الاستخدام النهائي للخلايا ، ينبغي تصفية تعقيم عندما تكمل aliquoted والمجمدة أو قبل بالإضافة إلى الخلايا. </li></ol> باء جسم التحديد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليس كل الأجسام المضادة فعالة في تنشيط تكمل ، وبالتالي يجب أولا أن يتم اختبار الأجسام المضادة للنشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل من الفأر والجرذ خريطة موقع فعالة في تنشيط المتممة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضداد الغلوبولين المناعي عادة ما تكون الأكثر كفاءة لاستخدامها في استكمال تحلل الخلايا التي يسببها تلاه مفتش الحكومة. وisotypes مفتش أفضل لتفعيل تكمل تختلف بين الأنواع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي لكل معاير الضد للاستخدام الأمثل في مناطق ذات كثافة خلية من خلايا 7 10 / مل. </li></ol> جيم البروتوكول الأساسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط خلية السكان بدأوا 5 × 10 7 خلايا / مل في المتوسط ​​تحتوي على السفح الحرارة المعطل. والحجم النهائي للخلايا يكون ضعف حجم انطلاق. تذكر لانقاذ بعض الخلايا بحيث يمكن قياسها كميا للنضوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يضاف إلى كل الأضداد تعليق خلية في تركيز مناسب محدد سلفا أو التخفيف. مزيج جيد من قبل خلايا قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب كمية تكمل الحاجة. تحسن الأسهم تكمل في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يتم استكمال عقيمة ، تعقيم باستخدام بروتين منخفض طرف الحقنة ملزمة التصفية. إلى المحقنة ، إضافة مل العديد من المتوسط ​​قبل إضافة تكملة وتصفية مباشرة في أنبوب يحتوي على الخلايا والأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط حجم النهائي في الأنبوب بحيث الخلايا هي الخلايا في 1 × 7 10 / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا على 37 درجة مئوية لمدة ساعة ، وخلط كل 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع المتوسط ​​مرتين. سوف حطام خلية العصا إلى جانب أنابيب البوليسترين. ويمكن التخلص من الخلايا الميتة والحطام باستخدام مصفاة الخلية أو عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من نقاء الخلية بمقارنة السكان خلية من الفائدة قبل وبعد نضوب. التدفق الخلوي والمناعية هما طرق جيدة لتحديد نقاء الخلية. </li></ol> ممثل النتائج عند استخدام خريطة موقع الذي يتم كفاءة عالية في تفعيل استنفاد تكملة الخلية ، وبعد جولة واحدة أكبر ثم 95 ٪. هذا هو مبين في الشكل 1 حيث بدأنا مع splenocytes الماوس تتألف من 32.2 ٪ في الخلايا التائية αβ الكشف عنها بواسطة التعبير عن TCRβ (eBioscience ، سان دييغو ، كاليفورنيا) التي التدفق الخلوي. نحن المنضب الخلايا التائية باستخدام خريطة موقع لThy1 محددة ، وهو بروتين التي أعربت عنها جميع الخلايا التائية ، ولكن ليس غيرها من الكريات البيض. كان الضد كنا Y - 19 فأرا IgG2c 2. ووصف الإجراء التالي ، تم تخفيض عدد السكان TCRβ إلى 1.56 ٪ ، مما يمثل انخفاضا أكبر من 95 ٪. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. نضوب thy1 + تم الحصول عليها من قبل الخلايا التائية الطحال تنشيط المتممة. splenocytes بواسطة الماوس إجمالي تجانس الطحال وتحلل من RBC. أضيفت مكافحة thy1 والطفل تكمل الأرنب بتركيزات محددة سلفا على تعليق خلية واحدة من هذه splenocytes أن تركيز الخلية النهائية 1 × 10 7 خلايا / مل. بعد حضانة لمدة 1 ساعة إلى 37 درجة مئوية ، وكانت تغسل الخلايا مرتين وتقييمها من قبل الاستبعاد التريبان الأزرق للبقاء الخلية. تم تقييم كفاءة من قبل استنفاد التدفق الخلوي مقارنة النسبة المئوية للخلايا + TCRβ قبل استنفاد (اللوحة اليسرى) وبعد استنفاد (اللوحة اليمنى). شريط أفقي يشير إلى تلطيخ إيجابية وعدد من فوق العارضة في المئة ايجابية.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

عملية تنقية للسكان الخلية هو إجراء المشتركة اللازمة لدراسة وظائفها. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفعالة للأوزون السكان الخلية باستخدام مستضد محددة الأضداد ونقص المتممة. لا يمكن أن يتحقق استنفاد أية مجموعة من السكان الخلية إذا كان الضد - تكمل تفعيل متاح للعلامة محددة النسب. وأعرب بروتين هنا أثبتنا استنفاد الخلايا التائية باستخدام خريطة موقع لThy1 محددة ، وذلك أساسا جميع السكان الخلايا التائية. المنضب لدينا أكثر من 95 ٪ من الخلايا التائية αβ وزيدت splenocytes المتبقية من 68 ٪ إلى 98 ٪. هذا المستوى من النقاء الخلية استراتيجيات مماثلة لتنقية الأخرى بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والانفصال حبة المغناطيسي. نضوب تكمل هي تقنية السريعة التي يمكن أن يؤديها في 1.5 ساعة مرة واحدة يتم الحصول على السكان خلية البداية. ميزة أخرى لاستنفاد تكملة هو أن أي مختبر يمكن أن تؤدي هذه التقنية لأنها لا تتطلب معدات باهظة الثمن والكواشف. القطع الكبير الوحيد المعدات المطلوبة هي حمام الماء وأجهزة الطرد المركزي ملف. يمكن شراؤها يكمل الأرنب من مجموعة متنوعة من الباعة بتكلفة معقولة (انظر الجدول الكواشف) ويمكن شراؤها من العديد من خريطة موقع ATTC والمنتجة محليا للسيطرة على التكاليف. في المقابل ، FACS يتطلب تدفق عداد الكريات مع قدرة على فرز الخلية التي ستكلف في الأرقام الستة ومكلفة خريطة موقع الموسومة fluorescently. الفصل المغناطيسي هو حبة بأسعار معتدلة ، ولكن يتطلب شراء المغناطيس والخرز المغناطيسي ، والتي يمكن أن تكون مكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، بعض استراتيجيات الفصل المغناطيسي حبة يتطلب أيضا شراء من الأعمدة. وحجر العثرة الاساسي هو لاستخدام تكملة لنضوب الخلية هو توافر تكمل تفعيل خريطة موقع مع خصوصية المستضد اللازمة. على الرغم من أن الإنسان ، والفأر والجرذان الأضداد جميعا القدرة على استكمال الإصلاح ، وبعض isotypes هي أفضل من غيرها. على الرغم من الغلوبولين المناعي من جميع الأنواع الثلاثة هي فعالة للغاية في تحديد تكمل isotypes مفتش تختلف. يجب أولا ومن ثم يتم اختبار كل خريطة موقع في دراسة تجريبية لتحديد مدى فعاليته. عن الأجسام المضادة التي ليست ذات كفاءة عالية ، يمكن إجراء جولتين من استنفاد تكملة دون التأثير على سلامة السكان الخلايا المتبقية. كما وفورات في التكاليف ، ينبغي معاير الأجسام المضادة للفعالية المثلى. بالإضافة إلى ذلك ، أن الأجسام المضادة المستخدمة لا تحتاج إلى تنقية. supernatants ورم هجين واستسقاء السوائل فقط العمل بشكل فعال ، وهو أمر مريح خصوصا للأضداد الغلوبولين المناعي ، والتي هي صعبة لتنقية. كما هو الحال مع الأضداد ، فمن المحتم أن يكون مكملا معاير في الدراسة التجريبية. وهناك تركيز عال جدا يؤدي الى فقدان قابلية للسكان الخلية غير المستهدفة. المهم أيضا هو أن فترة حضانة لا تتجاوز 60 دقيقة. في بروتوكول لدينا ، فقد شاركنا في احتضان هذه الأضداد وتكمل معا. ومع ذلك ، يمكن أن توصف الخلايا مع الأجسام المضادة لل15-30 دقيقة ويغسل قبل إضافة متممة. عند استخدام هذه الاستراتيجية ، للتأكد من تنفيذ حضانات الأضداد على الجليد لمنع فقدان الخلية المستضد على سطح الخلية ، كما يحدث مع بعض البروتينات التي ترميم وتغطية أو استيعاب مستقبلة. على الرغم من كفاءة عالية ، والعيب الرئيسي لاستكمال استنزاف بالمقارنة مع الأساليب الأخرى هو أنه لا يمكن استخدامها لاختيار ايجابية. وبالتالي فمن الصعب الحصول على مجموعات سكانية فرعية من الخلايا. على سبيل المثال ، سيكون من الصعب تطهير المنطقة الهامشية خلايا من خلايا B B الجريبي ، والتي من الأفضل أن يقوم به نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الحالة ، يمكن أن تستخدم لتنشيط تكملة تستنفد خلايا تي للحد من عدد الخلايا التي تم فرزها. وهذه الاستراتيجية تقليل الوقت الفرز ، التي من شأنها توفير المال وستكون أقل قسوة على الخلايا. منذ تنقية خلية معينة من السكان هو مطلب مشترك وضعت عددا من الاستراتيجيات. المزايا الرئيسية للاستراتيجية مكملة لها القدرة على تحمل التكاليف ونضوب ، بساطة التقنية وتوفير الوقت.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية الخلايا المناعية للسكان من أجل دراسة وظائفها الفريدة. في النهج ، ولا سيما الجزيئية مثل PCR الوقت الحقيقي وتحليل [ميكروأري تتطلب عزل السكان الخلية مع نقاء عالية. استراتيجيات تشمل تنقية استخداما الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS) ، والفصل المغناطيسي حبة ونقص المتممة. من الاستراتيجيات الثلاث ، واستنفاد تكملة يوفر مزايا يجري بسرعة ، وغير مكلفة ، لطيف على الخلايا والخلايا عالية الغلة. ويتألف النظام من استكمال عدد كبير من بروتينات البلازما أنه عندما يشرع في تنشيط بروتين تتالي بلغت ذروتها في تشكيل مجمع غشاء الهجوم الذي يشكل المسام على سطح الخلية مما يؤدي إلى موت الخلايا<sup&gt; 1</sup&gt;. يتم تنشيط المسار الكلاسيكي بواسطة أضداد IgM و IgG و كان أول وصف كآلية لقتل البكتيريا. مع جيل من الاجسام المضادة (ماب) ، يمكن استخدام سلسلة مكملة لأية مجموعة من السكان ليز الخلية بطريقة مستضد محدد. ويتحقق استنفاد الخلايا التي تكمل سلسلة بإضافة أضداد تحديد تكمل محددة مستضد ويكمل الأرنب للسكان خلية البداية. يتم تحضين هذه الخلايا لمدة ساعة في وقت لاحق تتم إزالة 37 درجة مئوية ، والخلايا التي lysed جولتين من الغسيل. ماب مع الكفاءة العالية لاستكمال تثبيت تستنزف عادة 95-100 ٪ من السكان الخلية المستهدفة. اعتمادا على استراتيجية تنقية للسكان الخلية المستهدفة ، ويمكن استخدام استنفاد تكملة لتنقية الخلية أو لإثراء سكان الخلية التي يمكن تنقيته ثم مزيدا من طريقة لاحقة.

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion at JoVE.com

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

لدراسة فعالية وظيفة الخلايا المناعية للسكان هو مطلوب في كثير من الأحيان لتنقية بهم. نضوب تكمل هي تقنية سريعة وغير مكلفة لعزل السكان الخلايا المناعية مع درجة نقاوة عالية.

نضوب بالسكان خلية معينة من قبل استنفاد تكملة

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

قياس يكمل 50 ٪ الدم الانحلالي (CH 50) نشاط المصل

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

نضوب وإعادة إعماره الضامة في الفئران

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...