Name: depletion of specific cell populations by complement depletion
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00
Duration: 6 min 17 s
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나는 그림 1의 데이터를 제공 Sreemanti Basu 감사하고 싶습니다. 이 작품은 NIH 부여 AI069358 및 BloodCenter 연구 재단에 의해 부분적으로 지원되었다.

A. 래빗 보완 <ol><li> 주식 토끼 보완은 상온에서 해동 후 0.5 및 / 또는 1 ML 볼륨에 aliquoted과 ° C 장기 저장을위한 -20-80에서 냉동해야합니다. </li><li> 보완 각각의 많은 최적의 작업 농도를 결정하기 위해 titrated해야합니다. 일반적으로, 1시 10분에서 1시 20분까지의 희석이 최적입니다. </li><li> 토끼 보완은 항상 세포의 최종 사용에 따라 이전에 판매 presterilized 아니라, 보완은 aliquoted 때 소독 필터링 사전 세포 이외에 냉동하거나해야합니다. </li></ol> B. 항체 선택 <ol><li> 모든 항체 따라서 항체가 처음 활동에 대한 검사를해야하며, 보완 활성화에 효과적입니다. </li><li> 마우스 및 쥐 mAb 모두 보완 활성화에 효과적입니다. </li><li> IgM 항체는 IgG 다음 보완 유도된 세포 용해에 사용하기 위해 일반적으로 가장 효율적인 수 있습니다. 최고의 보완 활성화에 대한 IgG의 isotypes, 종족 간의 다릅니다. </li><li> 각 항체는 10 7 셀 / ML의 세포 밀도에 최적 사용하기 위해 titrated해야합니다. </li></ol> C. 기본 프로토콜 <ol><li> 5 시작 세포 인구를 조절 매체를 포함하는 열 inactivated FCS에서 X 10 7 세포 / ML. 세포의 최종 볼륨을 두 번 시작 볼륨 것입니다. 고갈을 계량 수 있도록 몇 가지 세포를 저장하는 기억하십시오. </li><li> 각 항체는 적절한 정해진 농도 또는 희석에 세포 현탁액에 추가되어 있어야합니다. 잘 역전하여 세포를 섞는다. </li><li> 필요한 보완의 양을 계산합니다. 상온에서 보완 주식을 녹여. 보완이 멸균되지 않은 경우, 그것이 낮은 단백질 바인딩 주사기 팁 필터를 사용하여 소독. 주사기하려면, 보완을 추가하기 전에 중간 여러 ML을 추가하고 세포와 항체가 들어있는 튜브에 직접 필터. </li><li> 세포는 1 X 10 7 셀 / ML에 있습니다 있도록 튜브의 마지막 볼륨을 조정합니다. </li><li> 15 분 간격으로 혼합 한 시간 동안 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 세포를 원심과 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 매체와 함께 두 번 씻으십시오. 세포 파편 폴리스티렌 튜브의 측면에 집중합니다. 죽은 세포와 부스러기는 셀 스트레이너 또는 밀도 기울기 원심 분리에 의해 제품을 사용하여 제거하실 수 있습니다. </li><li> 고갈 전후 관심의 세포 인구를 비교하여 세포 순결을 확인합니다. 유동세포계측법 및 immunohistochemistry는 세포 순도를 결정하는 두 가지 좋은 방법입니다. </li></ol> 대표 결과 한 라운드 후 보완, 세포 고갈을 활성화에 매우 효율적입니다 mAb를 사용하면하면 다음 95% 큽니다. 이것은 우리가 유동세포계측법에 의해 TCRβ 표현 (eBioscience, 샌디에고, CA)에 의해 감지와 같은 32.2 %의 αβ의 T 세포로 구성된 마우스 splenocytes 시작 그림 1에 표시됩니다. 우리는 mAb Thy1에 대한 구체적인 모든 T 세포에 의해 표현 단백질지만, 다른 건 못 leukocytes를 사용하여 T 세포를 고갈. 우리가 사용하는 항체는 Y - 19 쥐를 IgG2c이되었습니다. 설명된 절차에 따라, TCRβ 인구는 1.56 % 이상 95 % 감소로 감소했다. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. thy1의 고갈은 + 보완 활성화하여 지라 T 세포. 총 마우스 splenocytes는 RBC의 비장과 용해의 균질하여 얻을 수 있었다. 안티 thy1하고 사전에 정해진 농도의 아기 토끼 보완은 최종 세포 농도는 1 X 10 7 셀 / ML 것을 같은 splenocytes의 단일 세포 현탁액에 추가되었습니다. 37에서 1 시간 동안 배양 후 ° C, 세포가 두 번 씻어 및 세포 생존을위한 trypan 파랑 배제에 의해 평가되었다. 고갈의 효율 고갈 (왼쪽 패널) 전에 고갈 (오른쪽 패널) 이후 TCRβ + 세포의 비율을 비교 유동세포계측법에 의해 평가되었다. 수평 막대는 긍정적인 얼룩을 나타내며 막대 위에있는 숫자는 긍정 %입니다.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

세포 인구의 정화는 기능의 연구에 필요한 일반적인 절차입니다. 여기 우리는 항원 - 항체 및 구체적인 보완 고갈을 사용하여 셀 인구 파괴의 신속하고 효과적인 방법을 설명합니다. 보완 - 활성화 항체가 혈통 특정 마커를 사용할 경우 모든 세포 인구의 고갈이 형성될 수 있습니다. 여기에 우리가 Thy1에 대한 mAb를 사용하여 특정 T 세포의 고갈을 시연, 단백질은 본질적으로 모든 T 세포 집단에 의해 표시됩니다. 우리는 αβ T 세포의 95 % 이상 고갈 나머지 splenocytes는 68%에서 98 %로 증가했다. 세포 순결의이 수준은 외과와 ​​자석 구슬 분리 등 다른 정화 전략과 비슷합니다. 보완 고갈이 시작 셀 인구가 획득되면 1.5 시간에 수행할 수있는 빠른 방법입니다. 보완 고갈의 또 다른 장점은 고가의 장비와 시약을 필요로하지 않기 때문에 모든 실험실이 기법을 수행할 수있다는 것입니다. 필요한 장비의 유일한 주요 작품은 물 목욕과 원심 분리기입니다. 토끼 보완은 저렴한 비용으로 다양한 공급 업체에서 구입하실 수 있습니다 (시약의 표 참조) 많은 mAb는 ATTC에서 구입하여 비용을 관리하는 로컬 성장하실 수 있습니다. 반면, 외과는 여섯 숫자와 비싼 찬란 태그 mAb의 비용 셀 정렬 용량 흐름 cytometer이 필요합니다. 마그네틱 비드 분리 알맞게 가격이지만, 치명타가 될 수 있습니다 자석과 자석 구슬의 구입이 필요합니다. 또한, 일부 자기 비드 분리 전략은 또한 컬럼의 구입이 필요합니다. 세포 고갈에 대한 보완의 사용에 가장 큰 걸림돌이 필요한 항원 특이성과 mAb를 활성화 보완의 가용성이다. 인간, 마우스 및 쥐 항체가 모두 보완 문제를 해결하는 능력을 가지고 있지만, 일부 isotypes 다른보다됩니다. 세 종 IgM은 보완을 고치에서 매우 효과이지만, IgG의 isotypes이 다릅니다. 따라서 모든 mAb 먼저 그 효과를 확인하기 위해 파일럿 연구에서 테스트해야합니다. 고효율되지 않은 항체 들어, 보완 고갈의 두 라운드가 남아있는 세포 집단의 생존에 영향을주지 않고 수행할 수 있습니다. 비용 절감으로 항체는 최적의 효과에 대한 titrated해야합니다. 또한, 사용되는 항체는 정화가 필요가 없습니다. 정화 어렵습니다 IgM 항체, 특히 편리합니다 마찬가지로 효과적으로 하이 브리 도마 supernatants 및 복수 유체 작업. 항체와 마찬가지로 그것은 보완이 파일럿 연구에서 titrated하는 것이 필수적입니다. 농도의 너무 높은가 아닌 타겟 세포 인구의 생존 능력의 손실을 초래합니다. 또한 중요 부화 시간이 60 분 초과하지 않는다는 것입니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 함께 항체와 보완을 공동 품어. 그러나, 세포는 15-30분에 대한 항체로 분류 사전 보완을 추가로 씻어 수 있습니다. 이 전략을 사용하는 경우와 같은 패치 및 상한 또는 수용체 국제화에 의해 일부 단백질과 발생, 세포 표면에있는 세포 항원의 손실을 방지하기 위해 얼음에 항체 incubations을 수행할 수 있는지 확인하십시오. 고효율이지만, 다른 방법에 비해 소모를 보완하기 위해 주요 단점은 그것이 긍정적인 선택에 사용할 수 없다는 것입니다. 그러므로 그것은 세포의 subpopulations를 얻을 어렵습니다. 예를 들어, 최고의 외과에 의해 수행 될 follicular의 B 세포에서 한계 영역 B 세포를 정화하기 어려운 것입니다. 이 상황에서, 보완 정품 인증이 정렬되는 세포의 수를 줄이기 위해 T 세포를 고갈하는 데 사용할 수 있습니다. 이 전략은 비용을 절감하는 것이있는, 정렬 시간을 줄일 것이며, 세포에 덜 거칠 것입니다. 특정 세포 집단의 정화는 일반적인 요구 사항이기 때문에 전략의 번호가 개발되었습니다. 보완 고갈 전략의 주요 장점은 경제성, 기술적 단순 및 시간 절감하고 있습니다.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

면역 세포 집단의 정화는 종종 자신의 고유의 기능을 연구하기 위해 필요합니다. 이러한 실시간 PCR과 microarray 분석 등 특히, 분자 접근법에서 고순도로 세포 인구의 격리를 필요로합니다. 일반적으로 사용되는 정화 전략은 형광 활성 세포 분류 (외과), 마그네틱 비드 분리 및 보완 고갈을 포함합니다. 세 전략, 보완의 고갈은 빠르고 저렴, 세포가 높은 세포 수율에 부드러운되는 장점을 제공합니다. 보완 시스템이 활성화되면 세포 사망의 결과 세포 표면에 기공을 형성하는 멤브레인 - 공격 복잡한 형성에 culminating proteolytic 층계를 시작 플라즈마 단백질의 다수로 구성되어 있습니다<sup&gt; 1</sup&gt;. 고전 경로는 IgM과 IgG 항체에 의해 활성화되며 첫 살해 박테리아를위한 메커니즘으로 설명했다. 단클론 항체 (mAb)의 세대, 보완 층계는 항원에 특정한 방식으로 모든 세포 인구를 lyse하는 데 사용할 수 있습니다. 보완 층계에 의해 세포의 고갈은 보완의 고정 항원에 특정한 항체를 시작 셀 인구 토끼 보완의 추가에 의해 이루어진다. 세포 ° C와 lysed 세포 세척 후 두 라운드에 의해 제거 37 한 시간 동안 incubated 수 있습니다. 보완의 고정을위한 고효율 MAb은 일반적으로 타겟 세포 인구의 95-100%를 고갈. 대상 세포 인구를위한 정화 전략에 따라 보완 고갈은 세포 정화 또는 다음 추가 후속 방법으로 정화 수있는 세포 집단의 강화에 사용될 수 있습니다.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.

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