Name: depletion of specific cell populations by complement depletion
Uploaded: 2010-02-05T14:00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion at JoVE.com

Я хотел бы поблагодарить Sreemanti Басу за предоставление данных для рисунке 1. Эта работа была выполнена при частичной поддержке гранта NIH AI069358 и Фонда BloodCenter исследований.

А. Кролик Дополнение <ol><li> Дополнять со кролика должно быть разморозить при комнатной температуре, а затем аликвоты в 0,5 и / или 1 мл объема и замораживают при -20-80 ° С в течение длительного хранения. </li><li> Каждая партия дополнение следует титровать для определения оптимальной рабочей концентрации. Как правило, разбавления 1:10-1:20 является оптимальным. </li><li> Кролик дополнением не всегда presterilized до продажи, в зависимости от конечного использования клеток, дополнения должны быть отфильтрованы стерилизовать при аликвоты и замороженных или перед добавлением к клеткам. </li></ol> Б. Антитела выбора <ol><li> Не все антитела эффективны при активации комплемента, таким образом, антитела должны быть сначала проверены на активность. </li><li> Обе мыши и крысы мАт эффективны при активации комплемента. </li><li> IgM антитела, как правило, наиболее эффективные для использования в дополнение вызванного лизиса клеток следуют IgG. IgG изотипов лучше для активации комплемента отличаются между видами. </li><li> Каждое антитело следует титровать для оптимального использования при плотности клеток 10 7 клеток / мл. </li></ol> C. Основные протокола <ol><li> Отрегулируйте начиная клеточной популяции до 5 х 10 7 клеток / мл в среде, содержащей тепла инактивированной FCS. Конечный объем клетки будет в два раза, начиная объема. Не забудьте сохранить некоторые клетки так, что истощение поддается количественной оценке. </li><li> Каждое антитело должна быть добавлена ​​к суспензии клеток на должном заданной концентрации или разведения. Смешайте клетки хорошо инверсии. </li><li> Рассчитать количество комплемента необходимо. Оттепель дополнением акции при комнатной температуре. Если дополнение не является стерильной, стерилизовать его, используя низкие связывания с белками фильтр наконечника шприца. Для шприц, добавьте несколько мл среды до того комплемента и фильтров непосредственно в пробирку, содержащую клеток и антител. </li><li> Отрегулируйте конечного объема в трубку так, что клетки на 1 х 10 7 клеток / мл. </li><li> Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение одного часа, смешивая каждые 15 минут. </li><li> Центрифуга клетки и отбросить супернатант. </li><li> Промыть среду в два раза. Сотовые мусора будет придерживаться стороны полистирола труб. Мертвые клетки и мусор может быть устранено при использовании фильтра ячейку или центрифугирования в градиенте плотности. </li><li> Проверьте чистоту ячейки путем сравнения клеточной популяции интереса до и после истощения. Проточной цитометрии и иммуногистохимии два хороших методов определения ячейки чистоты. </li></ol> Представитель Результаты При использовании МКА, что очень эффективно при активации дополнения, сотовые истощения после одного раунда больше чем 95%. Это показано на рисунке 1, где мы начали с мышью спленоцитов состоит из 32,2% клеток αβ T, которая была определена по выражению TCRβ (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния) с помощью проточной цитометрии. Мы обедненной T клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белка, выраженные всеми Т-клетки, но не других лейкоцитов. Антител мы использовали, была Y-19 крыс IgG2c 2. После процедуры, описанной, TCRβ населения сократилась на 1,56%, более чем 95%-ное снижение. <img src="/files/ftp_upload/1487/1487fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Истощение thy1 + Т-клеток селезенки к активации комплемента. Всего спленоцитов мыши были получены путем гомогенизации селезенки и лизис РБК. Анти-thy1 и ребенка кролика дополнения в заранее определенных концентрациях были добавлены к суспензии отдельных клеток спленоцитов, что конечная концентрация ячейки 1 х 10 7 клеток / мл. После инкубации в течение 1 часа при температуре 37 ° C, клетки промывают два раза и оценивается трипанового синего исключения для жизнеспособности клеток. Эффективность истощения оценивали с помощью проточной цитометрии сравнивая процент TCRβ + клеток до истощения (слева) и после истощения (правая панель). Горизонтальная полоса указывает на положительное окрашивание и выше номер бара процентов положительный.

<ol>
	<li>Janeway, C., Travers, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+System+in+Health+and+Disease.">The Immune System in Health and Disease.</a> Immunobiology. , (1994).</li><li>Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activities+of+antibodies+against+brain-associated+T+cell+antigens+II.+Stimulation+of+T+cell-induced+B+cell+proliferation.">Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation.</a> Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).</li></ol>

Очистка клеточных популяций распространенная процедура, необходимые для изучения их функций. Здесь мы опишем быстрый и эффективный метод истощения клеточных популяций использованием антиген-специфических антител и дополнения истощения. Истощение любой популяции клеток могут быть достигнуты, если комплемент-активации антител доступна для линии специфическим маркером. Здесь мы показали истощение Т клеток с помощью МКА, специфичные для Thy1, белок, выраженных по существу, все Т клеточные популяции. Мы обедненного более 95% αβ Т-клеток и оставшиеся спленоцитов были увеличены с 68% до 98%. Этот уровень клеточного чистоты похож на другие стратегии, в том числе очистка FACS и магнитные бусины разделения. Дополнение истощение быстрый метод, который может быть выполнен в 1,5 часов после начала клеточной популяции получается. Еще одно преимущество дополнением истощения в том, что каждая лаборатория может выполнять технику, поскольку она не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Только основные части оборудования, необходимого являются водяной бане и центрифуги. Кролик дополнение можно приобрести у различных производителей по разумным ценам (см. таблицу реагентов) и многие мАт можно приобрести у ATTC и выращенного для управления затратами. В отличие от этого, FACS требует потока цитометр с соты сортировки, которая будет стоить в шесть цифр и дорогих флуоресцентно меткой МАБ. Магнитный шарик разделение умеренным ценам, но требует покупки магнита и магнитных бус, который может быть дорогостоящим. Кроме того, некоторые магнитные бусины стратегии разделения также требуют покупки колонок. Основным камнем преткновения для использования дополнением для сотовых истощения является наличие комплемента активации МАБ с антигенной специфичности требуется. Хотя человека, мыши и крысы антител у всех есть возможность исправить дополнением, некоторые изотипов лучше, чем другие. Хотя IgM из всех трех видов является весьма эффективным при фиксации дополнением IgG изотипов меняться. Таким образом, каждый МКА должны быть сначала протестированы в рамках пилотного исследования с целью определения его эффективности. Для антитела, которые не являются высокоэффективными, два раунда дополнением истощения могут быть выполнены без ущерба для жизнеспособности оставшихся клеточных популяций. Как экономии средств, антитела следует титровать для оптимальной эффективности. Кроме того, антитела использоваться не должны быть очищены. Гибридома супернатанты и асцит жидкости работать так же эффективно, что особенно удобно для IgM антитела, которые трудно очистить. Как и антитела, крайне важно, чтобы дополнять титровать в экспериментальном исследовании. Слишком высокой концентрации может привести к потере жизнеспособности нецелевых клеточных популяций. Также важным является то, что инкубационный период не превышает 60 минут. В нашем протокол, мы сотрудничаем инкубировать антител и дополнять друг с другом. Тем не менее, клетки могут быть помечены с антителами в течение 15-30 минут и промывают до того комплемента. При использовании этой стратегии, убедитесь, что для выполнения антител инкубации на льду, чтобы предотвратить потерю ячейки антигеном на поверхности клетки, как это происходит с некоторыми белков исправлений и укупорки или интернализация рецепторов. Хотя высокоэффективным, главный недостаток в дополнение к истощению, по сравнению с другими методами является то, что она не может быть использована для положительного отбора. Таким образом, трудно получить субпопуляций клеток. Например, было бы трудно очистить маргинальной зоне В-клеток фолликулярного В-клеток, которые лучше всего сделать, FACS. В этой ситуации, активации комплемента могут быть использованы для Т-клеток, разрушающих уменьшить количество клеток быть отсортированы. Эта стратегия позволит снизить рода времени, что позволит сэкономить деньги и будут менее суровыми клеток. После очистки конкретных клеточных популяций является общим требованием ряд стратегий были разработаны. Основные преимущества стратегии истощения дополнением являются его доступность, техническая простота и экономия времени.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-4 week baby rabbit complement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pel-Freez Biologicals</td>
<td>31061-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water bath</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>various</td>
<td>various </td>
<td>An incubator set at 37 &deg;C can also be used.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

depletion of specific cell populations by complement depletion

Очистка иммунных клеточных популяций часто требуется для того, чтобы изучить их уникальные функции. В частности, молекулярные подходы, такие как ПЦР в реальном времени и микрочипов анализа требуют изоляции клеточных популяций с высокой чистоты. Обычно используемые стратегии очистки включают флуоресцентные активированный сортировки клеток (FACS), магнитно-бусинка разделения и дополнения истощения. Из трех стратегий, дополняют истощения предлагает преимущества быть быстрой, недорогой, нежный на клетки и высокий выход ячейки. Системы комплемента состоит из большого количества белков плазмы, что при активации инициировать каскад протеолитических кульминацией в формировании мембран-атаки комплекс, который формирует поры на поверхности клетки, что приводит к гибели клеток<sup&gt; 1</sup&gt;. Классический путь активируется IgM и IgG антител и был впервые описан в качестве механизма для уничтожения бактерий. С поколения моноклональных антител (МКА), каскад комплемента могут быть использованы для лизиса любой популяции клеток в антиген-специфической манере. Истощение клеток каскад комплемента достигается за счет того комплемента фиксации антиген-специфические антитела и кролика дополнением к начальной клеточной популяции. Клетки инкубировали в течение одного часа при температуре 37 ° С и лизировали клетки впоследствии удалены два этапа стирки. MAb с высокой эффективностью для связывания комплемента обычно разрушающих 95-100% целевой популяции клеток. В зависимости от очистки стратегии целевых популяции клеток, дополняют истощения могут быть использованы для клеточной очистки или для обогащения популяции клеток, которые затем могут быть дополнительно очищают последующий метод.

Watch this Scientific Journal Video about Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion at JoVE.com

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

Для эффективного исследования функции иммунной клеточной популяции их очистки часто требуется. Дополнение истощение быстрый и недорогой метод для изоляции иммунных клеточных популяций с высокой чистоты.

Истощение конкретные клеточные популяции путем дополнения Истощение

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Очистка Конкретные популяции клеток путем флуоресцентной Активированный Сортировка Cell (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Measuring the 50% Haemolytic Complement (CH50) Activity of Serum

Measuring the 50% Haemolytic Complement CH50 Activity of Serum

Измерение 50% Гемолитическая Дополнение (CH 50) Активность сыворотки

The complement system is a group of proteins that when activated lead to target cell lysis and facilitates phagocytosis through opsonisation. Individual ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Истощение и разведения макрофагов у мышей

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Визуализация иммунологических синапсов на двойной цвет времени закрытого вынужденного излучения истощения (STED) Наноскопия

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells

Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ

Antibodies against red blood cells (RBCs) can lead to complement activation resulting in an accelerated clearance via complement receptors in the liver ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Убийца Искусственный антигенпредставляющих клеток (KaAPC) для эффективного<em&gt; In Vitro</em&gt; Истощение человека антиген-специфических Т-клеток

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

порождающий<em&gt; De Novo</em&gt; Антиген-специфический человеческий Т-клеточный рецепторам трансдукции ретровирусных Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Визуализация актина и микротрубочек Cytoskeletons на B-клетки иммунной синапса, с помощью микроскопии простимулированное излучение истощения (интереса)

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...