Name: isolation of mouse peritoneal cavity cells
Uploaded: 2010-01-28T16:45:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells at JoVE.com

Эта работа была выполнена при частичной поддержке гранта NIH AI069358 и Фонда BloodCenter исследований.

<ol><li> Перед началом процесса, следующие элементы должны быть собраны и подготовлены: <ul><li> Лед </li><li> 5 мл шприц с иглой 27 г </li><li> 5 мл шприц с иглой 25g </li><li> Пенополистирол блока и булавки для крепления мыши </li><li> Лоток, на котором монтажный блок может быть размещен </li><li> Ножницы и пинцеты </li><li> Коллекция труб </li><li> 70% этанола </li><li> PBS с 3% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (предварительно охлажденных и держится на льду) </li></ul></li><li> Эвтаназии мыши, распылить это с 70% этанола и закрепить его на блок пенополистирола на спине. </li><li> Использование ножницы и щипцы сократить внешнюю оболочку брюшины и осторожно потяните его назад подвергать кожу внутренней подкладкой брюшную полость. </li><li> Inject 5 мл ледяной PBS (с 3% FCS) в брюшную полость использованием 27 г иглы. Нажимаем иглу медленно в брюшину стараясь не прокол любого из органов. </li><li> После инъекции массируют брюшины выбить все подключенные клетки в раствор PBS. </li><li> Вставьте иглу 25 г, конические вверх, прилагается к 5 мл шприца в брюшину и сбора жидкости при перемещении кончика иглы осторожно, чтобы избежать засорения жировой ткани или других органов. Сбор столько жидкости, сколько возможно, и депозит собраны клеточной суспензии в трубках держится на льду после удаления иглы от шприца. Дополнительно: Повторите шаг 4-6 </li><li> Сделайте разрез в коже внутренней брюшины и, удерживая до кожу щипцами использовать пластиковые пипетки Пастера, чтобы собрать остатки жидкости из полости. </li><li> Если в шаге 6 или 7 видимого загрязнения крови обнаруживается то загрязненные образцы должны быть отброшены. </li><li> Спиновые собраны клеточной суспензии при 1500 оборотов в течение 8 минут, удалите супернатант и ресуспендирования клеток в желаемый носитель или PBS для подсчета. </li></ol> Альтернативный протокол для получения тиогликолята вызвало макрофагов: Этот метод используется для получения высокой доходности макрофагов. <ol><li> Inject 5 мл 3% (м / о) Брюер тиогликолята средний (7) в брюшную полость каждого мыши. </li><li> Ждите в течение 3-5 дней, и переходите к шагу 1 выше, для сбора клеток. </li></ol> По сравнению с nonelicited подход, примерно в 10 раз больше макрофаги могут быть собраны. Единственной заботой является то, что макрофаги, полученные этим процедуры отличаются в некоторых из своих физиологических свойств. Представитель результаты: С unmanipulated мыши, 5-10 млн. перитонеальных клеток полости могут быть получены с хорошими протокол изоляции. Среди всех живых клеток, 50-60% составляют В-клетки, ~ 30% макрофагов и 5-10% являются Т-клетки (рис. 1). <img src="/files/ftp_upload/1488/1488fig1.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1. Фенотип клеток, выделенных из брюшной полости. После изоляции перитонеальных клеток полости они были окрашены антимышиным TCRβ-FITC, B220-PE-Техас красный, CD11b-Тихоокеанского синий, CD23-PE-Cy7 и CD5-APC. Представитель проточной цитометрии графики показывают процент B и Т-клетки (а), макрофагов (б), B1 и B2 клеток (с) и B1a и B1b клеток (г).

<ol>
	<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages.">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , (2008).</li><li>Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+of+natural+immunoglobulin+M+in+immediate+defense+against+systemic+bacterial+infection.">A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection.</a> J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).</li><li>Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+clearance+by+anti-phosphocholine+antibodies+as+a+mechanism+of+protection+in+experimental+pneumococcal+bacteremia.">Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia.</a> J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).</li><li>Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B1+B+lymphocytes+play+a+critical+role+in+host+protection+against+lymphatic+filarial+parasites.">B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites.</a> J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).</li><li>Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+mouse+peritoneum+contains+a+large+population+of+Ly-1++(CD5)+B+cells+that+recognize+phosphatidyl+choline:+relationship+to+cells+that+secrete+hemolytic+antibody+specific+for+autologous+erythrocytes.">Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes.</a> J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).</li><li>O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly-1+B+(B-1)+cells+are+the+main+source+of+B+cell+derived+interleukin+10.">Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10.</a> Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).</li><li>Hoover, D. L., Nacy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+to+kill+Leishmania+tropica:+Defective+intracellular+killing+of+amastigotes+by+macrophages+elicited+with+sterile+inflammatory+agents.">Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents.</a> J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).</li><li>Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture.">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).</li><li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage+colony-stimulating+factor,+CSF-1.">The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1.</a> Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).</li><li>Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+B-1+and+B-2+cells+in+immune+protection+from+influenza+virus+infection.">The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).</li><li>Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+and+B-2+cell-derived+immunoglobulin+M+antibodies+are+nonredundant+components+of+the+protective+response+to+influenza+virus+infection.">B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).</li><li>Berland, R., Wortis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+functions+of+B-1+cells+with+notes+on+the+role+of+CD5.">Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).</li></ol>

Выделение перитонеальных клеток полости важный метод для изучения различных иммунных клеток, в первую очередь макрофаги и конкретные подмножества клеток. Хотя это простой процесс, Есть некоторые критические этапы. Наличие загрязняющих крови в собранных образцов следует избегать, чтобы получить чистые популяции клеток перитонеальной полости. Эвтаназия цервикальным сдвигом должно быть сделано аккуратно, чтобы избежать загрязнения крови в брюшной полости. Кроме CO 2 может быть использован. Кроме того, во время процедуры надлежащего ухода должны быть приняты, чтобы избежать проколов пузырь или любых других органов в брюшную полость. Восстановление большинство вводимой жидкости также имеет важное значение в ячейку доходности. Эта процедура широко используется для изучения биологии макрофагов с умеренным количеством житель, нестимулированных макрофаги могут быть легко получены из брюшной полости, в отличие от трудоемкой задачей дифференциации миелоидных клеток-предшественников в зрелые макрофаги в пробирке, используя макрофаг колониестимулирующий фактор (8 , 9). Макрофагов выход из брюшной полости может быть улучшено с помощью метода тиогликолята выявление, хотя тиогликолята использование могло бы изменить физиологические свойства макрофагов (7). В-клетки являются важной частью нашей иммунной системы играет решающую роль в обоих врожденного и адаптивного иммунитета. Среди различных субпопуляций В-клеток, В1 клетки составляют уникальное подмножество B клеток, участвующих в врожденного иммунитета, аутоиммунные заболевания и иммунной регуляции. В1 клетки в основном расположены в брюшной полости и не требуют пополнения. Они являются одним из первичных производителей природного IgM, которая обеспечивает первую линию защиты против ряда вирусов и бактерий (10-12). В1 клетки также основным источником IL-10 (6), который является важным цитокинов, участвующих в иммунной регуляции. Хотя некоторые исследования были проводиться с В1 клетки, по-прежнему есть возможности для дальнейшей оценки их контрастные функций, специально их регулирующей роли. Брюшную полость изолятор метод дает уникальную возможность изучить функции B1 клеток.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Thioglycollate Medium, Brewer Modified</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD BBL</td>
<td>211716</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of mouse peritoneal cavity cells

Брюшной полости является мембраной и заполненные жидкостью брюшной полости млекопитающих, в котором содержится в печени, селезенке, большинство из желудочно-кишечного тракта и других внутренних органов. Она таит в себе число иммунных клеток, включая макрофаги, В-клетки и Т-клеток. Наличие большого числа наивных макрофагов в брюшную полость делает его предпочтительным местом для сбора наивно ткани резидент макрофагов (1). Брюшной полости также имеет важное значение для изучения В-клетки из-за наличия уникальных брюшную полость-нерезиденты В-клеток подмножество известного как B1 клеток в дополнение к обычной ячейки B2. В1 клетки подразделяются на B1a и B1b клеток, которые можно отличить по поверхности выражение CD11b и CD5. В1 клетки являются важным источником природных IgM обеспечения раннего защиту от разнообразных патогенов (2-4). Эти клетки аутореактивных в природе (5), но как они находятся под контролем, чтобы предотвратить аутоиммунные до сих пор не поняли полностью. Напротив, CD5<sup&gt; +</sup&gt; B1a клетки обладают некоторыми регуляторными свойствами в силу их Ил-10 производственных мощностей (6). Таким образом, клетки перитонеального B1 полости интересные популяции клеток для изучения из-за их различных функций и много нерешенных вопросов, связанных с их развитием и регулированием. Изоляции брюшной полости резидент иммунных клеток является сложным из-за отсутствия определенной структуры внутри брюшной полости. Наш протокол опишу процедуру получения жизнеспособных клеток иммунной из брюшной полости мышей, которые затем могут быть использованы для фенотипического анализа методом проточной цитометрии и для различных биохимических и иммунологических анализов.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells at JoVE.com

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

Брюшной полости у млекопитающих содержит различные иммунные клеточные популяции важно для врожденного иммунного ответа. Эффективный метод изоляции требуется для биохимических и функциональных анализов этих клеток. Здесь мы предлагаем комплексный метод для изоляции брюшной полости в клетках мыши.

Выделение мышью перитонеальных клеток полости

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Выделение функциональных сердечно иммунных клеток

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Выделение мышиные клетки легких Дендритные

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Выделение и характеристика дендритных клеток и макрофагов из кишечника мыши

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Выделение лимфоцитов из половых путей мышь Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Изоляция жировой ткани иммунных клеток

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

Выделение перитонеальных макрофагов Carry Out Gene Expression анализ По Toll-подобные рецепторы стимуляции

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Выделение клеток Сертоли и перитубулярных Клетки крыс семенников

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Изоляция, фиксации и изображений иммунофлюоресценции мыши надпочечников

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

С помощью усиленной зеленый флуоресценции белков выражая Escherichia Coli оценить мыши перитонеальных макрофагов фагоцитоз

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...