Name: scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

ESB erkent financiering door New Innovator Award van de NIH directeur (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Grote kansen Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0,835,878 en 0,848,804), het McGovern Institute Neurotechnologie Award Programma , het ministerie van Defensie, NARSAD, de Alfred P. Sloan Foundation, Jerry en Marge Burnett, de SFN Research Award for Innovation in Neuroscience, het MIT Media Lab, de Benesse Foundation, en de Wallace H. Coulter Foundation.

1. Constructing stereotaxische Clamp <ol><li> De stereotaxische klem wordt gebruikt voor het bevestigen van de injector array om de stereotax, zodat de injectoren zijn parallel aan de stereotaxische arm. </li><li> Elk lab heeft slechts een klem, tenzij verwacht wordt dat meer dan een operatie kan gelijktijdig plaatsvinden. In dit geval voor hetzelfde aantal als het verwachte maximale aantal gelijktijdige operaties. Het zou ook aan te raden om een ​​extra te maken, in geval van schade aan de eerste. </li><li> Om de stereotaxische klem, in de eerste plaats is een 1,5 mm buitendiameter (OD) stalen canule gesneden om twee centimeter lang, en een van de uiteinden is Dremeled naar beneden tot vlak. </li><li> Vervolgens wordt een klein stukje (ongeveer 0,5 x 0,5 cm) snijden van PCB proto-board, om te worden gebruikt als een spacer. </li><li> Met behulp van een laser cutter om te waarborgen dat de gedane eventuele bezuinigingen loodrecht op het oppervlak van het materiaal, zijn twee identieke rechthoeken (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;), gesneden uit 1 / 8 &quot;acryl platen, elke rechthoek met twee ronde gaten in tegenoverliggende hoeken van de rechthoek. De eerste hole heeft een diameter van 1,5 mm, en is net groot genoeg om de metalen canule stevig vast te houden. De tweede gat heeft een diameter van 1 / 16 &quot;(Figuur 1C). </li><li> De metalen canule is ingebracht in de 1,5 mm gat van een rechthoek, vervolgens door de 1,5 mm gat van de tweede. De onderkant van de canule is uitgelijnd met de onderkant gezicht van de onderste rechthoek, die de vorm van een hockeystick. </li><li> Terwijl de spacer strak gehouden tussen de twee rechthoeken, is deze structuur bij elkaar gecementeerd met behulp van hete lijm rond de canule en 1,5 mm gaten, en let om te voorkomen dat het lijmen van de spacer aan de rechthoeken. Boetseerklei kan nuttig zijn om bij elkaar te houden dingen tijdens dit proces. </li><li> Nadat de lijm is gedroogd, wordt een 1-72 schroef ingebracht in de 1 / 16 gat vanaf de bovenkant van de rechthoeken. Dan is een 1-72 zeskantmoer is geschroefd op het einde van de 1-72 schroef, en aangescherpt. De schroef en moer dienen om de klem bij elkaar te houden. </li><li> U bevestigt de moer aan de onderkant gezicht van de onderste rechthoek, kleine hoeveelheden van de 5-minuten epoxy worden gedropt aan de rand van de moer, zonder dat de epoxy te krijgen in de schroefdraad van de moer of schroef. Elke boetseerklei wordt verwijderd, en het is bevestigd dat de spacer kan worden gehouden stevig op zijn plaats door het aandraaien van de schroef. </li></ol> 2. De voorbereiding van de voor de aangepaste injector array: Hamilton pomp en stereotax <ol><li> De injector array systeem kan worden aangepast aan vrijwel elke set van coördinaten in de hersenen. </li><li> De gebruiker eerst lokaliseert coördinaten van de gewenste injectieplaats in een muis (of andere soorten) de hersenen atlas, het omzetten naar de juiste coördinaten gebruikt door de stereotax (hier, X-, Y-en Z-coördinaten). Het aantal injectieplaatsen (drie in de figuren 1A en 1B) zullen hierna te noemen k. </li><li> k het aantal van 10 pl Hamilton spuiten worden geplaatst in een injectie / terugtrekking spuit pomp zoals deze van Harvard apparatuur. </li><li> Vervolgens drie meter lange stukken van polyethyleen buizen zijn aangesloten op de naald van elke Hamilton spuit. </li><li> Voor elk stuk van polyethyleen buizen, een F-252 buizen mouw van Upchurch Scientific is gleed over het open einde en bevestigd aan een P-627 buis adapter met de bijgeleverde moer en ring, ook van Upchurch Scientific. </li></ol> 3. De bouw van de op maat Injector Array <ol><li> Elke injector array wordt aangepast aan de set van de coördinaten die de gebruiker kiest. Echter, voor sets coördinaten die verschillen alleen door een vertaal-en / of rotatie, kan dezelfde injector array worden gebruikt. </li><li> Gezien alleen de relatieve X-en Y-coördinaten van de injectieplaatsen, zijn k gaten geboord in een PCB proto-board met een dikte van 1 / 32 &quot;, met dezelfde relatieve afstand. Deze gaten zijn geboord met behulp van een Modela mini-molen en een 0.011&quot; diameter boor van de McMaster-Carr. Zorg ervoor dat u een lage snelheid van het boren (Z-speed) gebruiken om te voorkomen breken of het dragen van de boor. Voor het verwijderen van de raad van bestuur van de molen, is een rechthoek geboord om de kleine gaatjes, met behulp van een grotere boor met een diameter 1 / 32 &quot;, om te voorkomen dat het dragen van de kleinere een Code voor de mini-molen kan worden gegenereerd met behulp van MATLAB gemakkelijk;. Monster code wordt in de volgende bestanden. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB-code voor het genereren van Modela code van de gewenste coördinaten </li><li> holes_ex.rml - Modela code voor het boren van belpatroon (acht holes) in de Proto-board </li><li> outline_ex.rml - Modela code voor het boren van gaten rechthoek rond </li></ol></li><li> 245 micrometer OD/100 um binnendiameter (ID) fused silica capillaire buis, verkrijgbaar bij Polymicro Technologies, wordt gesneden in het aantal k van 3 inch stukken. Deze omvatten de afzonderlijke injectoren. Een wegwerp stuk van de capillaire buis is gestoken doorelk van de gaten, op te ruimen puin, zonder verstopping van de werkelijke injectoren. De injectoren zijn nu halverwege vervolgens ingebracht in elk gat, zodat ze stevig en evenwijdig aan elkaar. De injectoren zijn geëpoxeerd aan het bestuur, de vorming van de structuur van de injector array. Het enige dat overblijft is voor de injectoren trimmen op de juiste lengte. </li><li> De injector array is verbonden met de stereotaxische klem door het plaatsen van een hoek van het proto-board tussen de acryl rechthoeken, en vervolgens door het aandraaien van de schroef van de stereotaxische klem. Vervolgens wordt de metalen canule van de klem aan de stereotax, met behulp van de bevestiging mechanisme van de stereotax. </li><li> Alle volgende wordt gedaan onder een microscoop. Voor een van de buitenste injectoren (dat wil zeggen, een die kan van de kant worden benaderd met een rechte rand, zonder stoten in een van de andere injectoren), wordt de tip verder reiken dan de onderkant van de proto-board knippen met een schaar. Voor de corticale injecties, is het aangewezen om de injector hebben de uitbreiding van ongeveer 5 mm boven het oppervlak van het proto-board. Voor diepere injecties, kan dit aantal worden verhoogd met de overeenkomstige toename in de diepte. De tip is afgeplat met een Dremel gereedschap. Injector tips kunnen ook de grond in een hoek als een extra voorzorgsmaatregel tegen verstopping, als precisie in de diepte is minder belangrijk. </li><li> Vervolgens wordt een stabiel referentiepunt gekozen binnen het bereik van de stereotaxische arm, en de injector array is zo ontroerd dat de platte uiteinde van de buitenste injector, is op dit referentiepunt. </li><li> Een tweede injector wordt gekozen, samen met de bijbehorende coördinaten. Overwogen, is het relatieve verschil in hoogte (z-richting) tussen de eerste en tweede injector coördinaten. De injector array wordt bewogen langs de Z-as door deze relatieve afstand. De tweede injector is bijgesneden en Dremeled op de juiste lengte, zodat het uiteinde van de tweede injector nu plat is en op de hoogte van het referentiepunt. De injector array kan worden verplaatst in de X-en Y-richting de vergelijking van de injector tip te vergemakkelijken met het referentiepunt. </li><li> Dit proces van trimmen wordt herhaald voor de overige injectoren. </li></ol> 4. Monteren van het gehele systeem <ol><li> De stereotaxische klem en op maat gemaakte injector array, beide reeds gebouwd, nodig zijn voor dit deel. </li><li> De achterkant einde van elke injector (het einde dat niet is getrimd) wordt ingebracht in een blauwe F-240 buizen mouw en, met behulp van een P-235 moer en P-200 ring van Upchurch Scientific, is bevestigd aan de schroefdraad adapter reeds aangesloten aan de pomp door Hamilton polyethyleen buis. Instructies van de fabrikant kan worden geraadpleegd voor meer informatie. </li><li> Met behulp van een 27-gauge naald, is siliconenolie geïnjecteerd in de achterkant van de Hamilton spuiten, zodat het hele systeem is gevuld vanuit de Hamilton spuit aan de injector tip, met geen luchtbellen helemaal. </li><li> Omdat de Hamilton spuiten opnieuw worden geplaatst in de Hamilton pomp, is de grootst mogelijke hoeveelheid siliconenolie gehandhaafd in de spuiten. </li><li> Als het experiment meer nodig spuiten dan de pomp is ontworpen voor (twee in dit geval), kan het spuiten worden gespreid met kleine stukjes plastic (bijv.-, naald-caps) om ze parallel aan elkaar, en ervoor te zorgen dat alle stukken zijn geduwd door de pomp in dezelfde mate. Of kan een multi-rack upgrade kit gekocht van Harvard Apparatus tot maximaal 10 spuiten in een keer. </li></ol> 5. Injecties / operatie <ol><li> Het proces van het injecteren met een parallelle injector is zeer vergelijkbaar met die van het injecteren met een pipet. </li><li> Het is essentieel om langzaam bijvullen gebruiken / tarieven trekken tijdens dit proces, omdat de pompen snel mogelijk nadruk te leggen op de verbinding tussen grote en kleine slangen. Aanbevolen max. snelheid: 2 pl / min voor het laden virus, en 0,1 pl / min voor infusie virus. </li><li> Een verdoofde muis wordt geplaatst in de stereotax, en blijft onder narcose gedurende het experiment. </li><li> Bereid de muis als dat nodig is. Bijvoorbeeld met een scalpel, is een enkele snede gemaakt naar de middellijn van de huid, van tussen de ogen tussen de oren. De huid is teruggetrokken naar de schedel bloot te leggen, en de fascia is schoongemaakt. Een getrokken glazen pipet is bevestigd aan de stereotax. De posities van het oor bars zijn aangepast totdat bregma en lambda zijn afgestemd op dezelfde hoogte, en zo dat de lijn die hen is evenwijdig met de Y-as van de stereotax. De assen van de stereotax zijn gericht volgens het coördinatensysteem waarin de injectie coördinaten zijn berekend. De stereotaxische is op nul gezet met de punt van de glazen pipet op bregma, en dan is de tip is gepositioneerd iets boven de schedel op de X-en Y-coördinaten van een van de injectieplaats. </li><li> Met behulp van een tandartsboor, is de schedel onder de tip voorzichtig weg vergeleken tot er nog een uiterst dun laagje van het bot. De glazen pipet kan lagered en getogen om te controleren of het gat wordt geboord is gecentreerd op de juiste positie. Met behulp van een 30-gauge naald, een klein stukje van de laag wordt voorzichtig geplukt, op de juiste X-en Y-coördinaten, zodat de dura mater is blootgesteld. Dit gat moet net groot genoeg om een ​​van de injectoren (0,25 mm breed) te passen. Zie figuur 1D voor diagram. Op deze manier, zijn klein, 0,25 mm brede gaten in de schedel, op de X-en Y-coördinaten die overeenkomen met elke injectie. </li><li> De glazen pipet is weggegooid in een naaldencontainer, en de aangepaste injector array is bevestigd aan de stereotax met behulp van de stereotaxische klem. </li><li> Om correct de hoek van de injector-array set, zijn twee buitenste injectoren gekozen worden gekalibreerd op een gegeven referentiepunt, als volgt. Na een van de injectoren is gekoppeld aan het referentiepunt, rekening houden met de relatieve X-en Y-afstanden tussen de injectieplaatsen met betrekking tot deze injector en een ander. De assen van de stereotax worden aangepast, zodat hele injector array is verplaatst in de X-en Y-richting door deze relatieve afstanden. Als de tweede injector is nu niet in lijn met het referentiepunt, is de metalen canule losgemaakt en gedraaid. Dit proces is iteratief herhaald tot de injector array is goed gehoekt. </li><li> Voor het vullen van de injectoren met het virus, zijn de injectoren gevuld met siliconen olie totdat de spuiten zijn op de 2 ul punt (of meer). Dit zorgt voor een bufferzone, zodat eventuele luchtbellen of verstopping in de punt kan gemakkelijk verwijderd worden door op olie uit het gebruik van de Hamilton pomp, zonder bij te vullen het hele systeem met siliconen olie uit de achterkant van het spuiten, zoals eerder beschreven. </li><li> Een steriele stuk Parafilm is geplaatst op de schedel, en de injectoren zijn voorzichtig zakken op de Parafilm. Voor de coördinaten met sterk wisselende dieptes, een op maat gefreesd deel (bijvoorbeeld een trap-vormig object) zou kunnen vergemakkelijken het laden. </li><li> De volgende onderdelen gaan ervan uit dat een ui van het virus is om te worden geladen op elke locatie (de volgende hoeveelheden moeten worden verlaagd als kleinere hoeveelheden zijn gewenst). Om te garanderen dat&gt; een ui van het virus wordt geïnjecteerd op elke locatie, is 1,5 ul van het virus gepipetteerd op de Parafilm of trap aan het uiteinde van elke injector. </li><li> Met het vullen tarief van de Hamilton pomp ingesteld op 1 pl / min, is 1,2 pi van het virus gevuld in elke injector. </li><li> De tip van de langste injector is op nul gesteld op bregma, en vervolgens de injector array is verschoven naar de X-en Y-coördinaten van die injector. Als verstopping is een probleem, zeggen als er veel diepe doelstellingen zijn betrokken: nog voor het plaatsen van de injector tips in de hersenen, is het soms aan te raden om de pomp infunderen te starten, totdat virus kan worden gezien die uit alle injector tips. Dit verwijdert eventuele luchtbellen in de injector tips, en zorgt er ook voor dat er geen verstopping. In het geval van verstopping, is het Hamilton pomp ingesteld op een korte puls dien met een hogere snelheid van 2 pl / min, zachtjes ruimen verstopping. </li><li> De injector array wordt dan verlaagd, door de kleine gaten gemaakt met de 30-gauge naalden, op de juiste Z-diepte. </li><li> 1 pi van het virus wordt geïnjecteerd door iedere injector, bij 0,1 pl / min. </li><li> De injecties worden met rust gelaten gedurende 30 minuten. </li><li> Nadat de injector array is langzaam uit de hersenen, is het Hamilton pomp ingesteld infusie met dezelfde snelheid van 0,1 pl / min, om te controleren op verstopping in elke injector. </li><li> Dan is de injectoren worden gereinigd te hervullen en infunderen van 1,5 ul van ethanol in 2 pl / min. </li><li> Tot slot worden de injectoren gevuld met siliconen olie om de 2 pl bufferzone in elk Hamilton spuit te houden. </li><li> Alle apparatuur moet worden gesteriliseerd voor en na de procedure, op basis van uw instelling bioveiligheid en gebruik van dieren protocollen. </li></ol> 6. Representatieve resultaten De parallelle injector reeks snelheden tot een operatie ongeveer met een factor gelijk aan het aantal van de injectoren, niet meegerekend setup en hersteltijd, hoewel individuele keer zal afhangen van de vaardigheid van de beoefenaar. Voor een 1 microliter injectie, we meestal zagen lentivirus uitdrukking in een sfeer van ongeveer een diameter van 1 mm (fig. 1E). De precisie van de injectie was zodanig dat de variabiliteit in tip positionering, van studie tot studie, was ongeveer 45 micron (standaard afwijking van de afstand tussen het uiteinde positie naar de beoogde top positie). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Design, implementatie en het gebruik van een parallelle virus injector array. A, schema van het parallelle injector array systeem, met een triple injector configuratie, voor drie gelijktijdige injecties. B, foto van een triple parallel injector reeks zoals schematisch in A . <stRong&gt; C, stereotaxische klem, weergegeven in hoofdlijnen uit de top D, illustratie van de techniek voor een efficiënte, schade-minimaliseren, de opening van gaten in de schedel voor de injector inbrengen in de hersenen:. met een tandartsboor, dun de schedel tot ~ 50 micron dik, gebruik dan de punt van een scherpe naald een kleine craniotomie te openen. E, fluorescentie plaatje channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-gelabelde cellen in drie muizen corticale gebieden, zoals het doelwit van de drievoudige injector reeks getoond in B.

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Alle procedures zijn in overeenstemming met de NIH Gids voor Proefdieren en goedgekeurd door het MIT Dierverzorging en Gebruik en bioveiligheid comites.

In de afgelopen jaren hebben een aantal van genetisch gecodeerde optische sensitizers mogelijk neuronen worden geactiveerd en zwijgen in vivo in een tijdelijk-nauwkeurige wijze, in reactie op korte pulsen van licht (bijv. 1,4,5,6,7,8 , 11). Een van de belangrijkste methode waarmee neuronen zijn gevoelig voor licht in de hersenen van zoogdieren, is via virussen zoals lentivirussen en adeno-geassocieerde virussen (AAV), die kunnen leveren genen die coderen voor opsins aan hersenen van dieren, variërend van muizen tot apen, in een een veilige en duurzame wijze (bijv. 2,9,10). Virussen laten een snellere doorlooptijd doen dan genetische manipulatie, met name voor organismen die geen genetisch model organismen, zoals ratten en apen, en voor opsins in staat kan stellen hoge expressie niveaus die niet mogelijk zijn in transgene scenario&#39;s. Hier laten we zien een parallel injector reeks in staat om, in een snelle tijdschaal &quot;circuit-level genetische manipulatie, &#39;waardoor gehele 3-dimensionale hersenstructuren te viraal worden gericht met een gen, in een enkele chirurgische stap. De injector reeks omvat een of meer verdringerpompen dat elk station een set van spuiten, die elk feeds in een polyimide / fused-silica capillaire via een hoge-druk-tolerant connector. De haarvaten zijn grootte, en vervolgens ingebracht in, de gewenste locaties die door de op maat frezen een stereotactische plaatsing bord, waardoor virussen of andere reagentia te leveren om de gewenste set van hersengebieden. Voor het gebruik van het apparaat, vult de chirurg eerst de vloeibare subsysteem volledig met olie, backfills de haarvaten met het virus, voegt het apparaat in de hersenen, en blaast reagentia langzaam (&lt;0,1 pL / min). Deze technologie zal zorgen voor een breed scala van nieuwe soorten experimenten, zoals de milliseconde-tijdschaal afsluiten van complexe,-vormige structuren (zoals de hippocampus) op precieze momenten in het gedrag, in tijd nauwkeurige inactivatie van bilaterale structuren die redundant kunnen optreden (zoals de linker en rechter amygdala) en de verstoring van meerdere discrete hersengebieden (bijvoorbeeld autorijden twee verbonden gebieden in fase om te bestuderen hoe cross-regio synchroon hangt af van activiteiten in elke regio, of het stimuleren van input voor een regio, terwijl zwijgen een subset van de doelstellingen om te begrijpen welke van de verschillende doelstellingen zijn van cruciaal belang voor het mediëren van de effecten van die ingangen). Voor grote hersenen, zoals die in de primaat, waarin we hebben onlangs aangetoond optische cel-type specifieke neurale activatie 3, storende activiteit in een gedragsmatig-relevante gebied kunnen virale etikettering van grote, complexe structuren nodig hebben. Wij merken op dat parallel injector arrays kunnen worden gebruikt voor bijna elke lading injecteren - drugs, neuromodulatoren, neurotransmitters, of zelfs cellen - in complexe 3-D patronen in de hersenen, in een tijdelijk-nauwkeurig. Tot slot, uit een translatie-standpunt, is het mogelijk dat een snelle, patiënt-customized gentherapie of drug delivery apparaten kunnen snel worden op maat ontworpen en gefabriceerd om individuele hersenen geometrieën overeenkomen, het ondersteunen van nieuwe behandelingen voor een verscheidenheid aan aandoeningen, mogelijk door het gebruik van optische controle moleculen. De injector arrays zijn ontworpen om precies te zijn, zowel ruimtelijk als volumetrisch. In de X-en Y-richting, wordt dit bereikt door het boren van heel nauwkeurig geplaatste gaten met behulp van een goedkope mini-molen, met de gaten net groot genoeg om de injectoren, zodat de injectoren parallel worden gehouden aan elkaar passen, en in een nauwkeurige locatie. In de Z-richting, zijn de injectoren bijgesneden met behulp van een stereotaxische apparaat, waardoor een niveau van precisie gelijk aan die van de stereotaxische operatie zelf. De volumetrische precisie komt voort uit de precisie van de Hamilton pomp, evenals de bijna-zero dead volume-connectors, aangepast van de hoge-druk vloeistofchromatografie (HPLC) veld. De injectoren zijn gemaakt van fused silica capillaire buis, die is sterk en stijf genoeg dat het precieze vorm en de afstand onder druk houdt, zonder dat de grotere wanddikte van alternatieven, zoals staal canules. Kleine wijzigingen kunnen gemakkelijk worden gemaakt om de parallelle injector reeks aan te passen aan een verscheidenheid van experimenten. Bijvoorbeeld, als een kleiner volume van het virus of fijner afstand nodig is, kunnen kleinere capillaire buizen worden gebruikt, samen met een bijbehorende kleinere boor. Toekomstige apparaten kunnen gebruik maken van microfluïdische kanalen en pompen, om het aantal parallelle injectoren te verhogen, om de grootte te minimaliseren (misschien waardoor dergelijke toestellen te worden gemonteerd op de hoofden van vrij bewegende dieren).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Ons begrip van neurale circuits - zou sterk worden vergemakkelijkt door een technologie voor het snel richten genen om complexe 3 - hoe ze de berekeningen die gebaat gevoel, gedachte, emotie, en actie, en hoe ze zijn beschadigd bij neurologische en psychiatrische stoornissen bemiddelen - dimensionale neurale circuits, waardoor een snelle creatie van &quot;circuit-level transgenen.&quot; We hebben recent ontwikkelde methoden, waarin virussen die coderen voor lichtgevoelige eiwitten kunnen specifieke celtypen gevoelig te milliseconde-tijdschaal activering en silencing in de intacte hersenen. We hier presenteren het ontwerp en de implementatie van een injector reeks staat het leveren van virussen (of andere vloeistoffen) om tientallen gedefinieerde punten in de 3-dimensionale structuur van de hersenen (<strong&gt; Afbeelding. 1A, 1B</strong&gt;). De injector reeks omvat een of meer verdringerpompen dat elk station een set van spuiten, die elk feeds in een polyimide / fused-silica capillaire via een hoge-druk-tolerant connector. De haarvaten zijn grootte, en vervolgens ingebracht in, de gewenste locaties die door de op maat frezen een stereotactische plaatsing bord, waardoor virussen of andere reagentia te leveren om de gewenste set van hersengebieden. Voor het gebruik van het apparaat, vult de chirurg eerst de vloeibare subsysteem volledig met olie, backfills de haarvaten met het virus, voegt het apparaat in de hersenen, en blaast reagentia langzaam (&lt;0,1 microliter / min). De parallelle karakter van de injector-array maakt een snelle, nauwkeurige en robuuste etikettering van volledige neurale circuits met virale ladingen zoals optische sensibilisatoren om licht-activatie en zwijgen van de gedefinieerde hersenen circuits. Samen met andere technologieën, zoals glasvezel-arrays voor het licht leveren om de gewenste sets van hersengebieden, hopen we een toolbox die de systematische indringende van causale neurale functies in de intacte hersenen mogelijk maakt. Deze technologie kan niet alleen open te stellen zulke systematische benaderingen van circuit gerichte neurowetenschappen bij zoogdieren, en vergemakkelijken de etikettering van de hersenen regio&#39;s in grote dieren, zoals niet-menselijke primaten, maar kan ook het openen van een klinisch pad voor translationeel cel-specifieke optische controle protheses , kan die precisie tot een betere behandeling van hardnekkige hersenaandoeningen. Tot slot kunnen dergelijke apparaten zoals hier beschreven te vergemakkelijken precies getimede vloeibare levering van andere payloads, zoals stamcellen en farmacologische stoffen, om drie-dimensionale structuren, in een gemakkelijk te gebruiker aan te passen mode.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Controleren en analyseren van neurale circuits<em&gt; In vivo</em&gt; Zou worden vergemakkelijkt door een technologie voor de levering van virussen en andere reagentia tot de gewenste drie-dimensionale sets van hersengebieden. Tonen we aan op maat vloeibare injector reeks fabricage en levering van viraal-gecodeerde optische sensitizers, waardoor optische manipulatie van complexe hersenen circuits.

Schaalbare fluïde Injector-arrays voor Virale Targeting van Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Targeting van Deep Brain Structuren met micro-injecties voor de levering van drugs, virale vectoren, of Cell Transplantaties

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intact Histologische Karakterisering van Brain-geïmplanteerde Microdevices en het omringende weefsel

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected<em&gt; In Vivo</em&gt; Met<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Modificatie van een Colliculo-thalamocorticale Mouse Brain Slice, Integratie 3-D printen van Chamber Components en multi-scale Optische beeldvorming

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered neuronale culturen op micro-elektrode arrays: een innovatieve<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Ontwikkeling van HiPSC-afgeleide serumvrije embryoïde lichamen voor de ondervraging van 3-D stamcelculturen met behulp van fysiologisch relevante analyses

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Generatie van 3-D collageen-based hydrogels om axonale groei en gedrag te analyseren tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...