Name: scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

ESB는 NIH 원장의 새로운 이노 수상 (OD002002 - 01 DP2), NIH 도전 그랜트 1RC1MH088182 - 01, NIH 그랜드 기회 부여 1RC2DE020919 - 01, NIH 1R01NS067199 - 01, NSF (0835878 및 0848804), 맥거번 연구소 Neurotechnology 보너스 프로그램에 의해 자금 인정 , 국방, NARSAD, 알프레드 P. 슬로안 재단, 제리와 마지 버넷, 신경 과학, MIT 미디어랩, Benesse 재단과 월러스 H. 쿨터 재단의 혁신을위한 SFN 연구 수상의학과.

1. Stereotaxic 클램프를 건설 <ol><li> stereotaxic 클램프는 인젝터가 stereotaxic 팔이 평행 있도록 stereotax에 인젝터 배열을 연결하는 데 사용됩니다. </li><li> 그것이 하나 이상의 수술이 동시에 자리를 차지할 수있는 예상되지 않는 각각의 연구실에서 단 하나의 클램프 필요합니다. 이 경우, 동시 수술의 예상 최대 번호와 같은 번호를 확인합니다. 또한 처음에 손상의 경우, 추가를하는 것이 좋습니다 수도 있습니다. </li><li> stereotaxic 클램프하려면, 첫째로, 1.5 mm 외경 (OD) 강철 정맥은 길이 2 인치 절단되고 끝을 중 하나가 평면 때까지 Dremeled입니다. </li><li> 다음, 작은 조각 (약 0.5 X 0.5 cm)는 스페이서로 사용, PCB 킬로그램 보드 밖으로 절단합니다. </li><li> 의 모든 상처가 재료의 표면에 직각되는 것을 보장하기 위해 레이저 커터를 사용하여 두 개의 동일한 직사각형 (1 / 2 &quot;X 8분의 3&quot;는) 1 / 8 &quot;아크릴 판금, 두 원형 구멍을 가지고 각각의 사각형에서 버렸어요 사각형의 반대 구석. 첫 번째 구멍은 1.5mm 직경을 가지고 있으며, 단지 단단히 금속 정맥을 가질 정도로 큽니다. 두 번째 구멍은 직경 16분의 1 &quot;(그림 1C)을하고 있습니다. </li><li> 금속 정맥은 두 번째의 1.5 mm 구멍을 통해 다음 하나의 사각형의 1.5 mm의 구멍에 삽입됩니다. 정맥의 아래 끝은 하키 스틱의 모양을 형성 하단 사각형의 하단 표정으로 정렬됩니다. </li><li> 단단히 두 사각형 사이에 개최되는 공백을 유지하면서,이 구조는 gluing에게 사각형에 공백을 피하기 위해주의되는, 정맥 및 1.5mm 구멍 주위에 뜨거운 접착제를 사용하여 함께 초경 있습니다. 모델링 점토는이 과정에서 함께 물건을 개최 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 접착제가 마른 후 1-72 나사는 직사각형의 맨 측면에서 16분의 1 구멍에 삽입됩니다. 그런 다음 1-72 헥스 너트가 1-72 나사의 끝 부분에 실수를하고, 강화입니다. 나사와 너트가 함께 클램프를 잡아 제공하고 있습니다. </li><li> 아래쪽 사각형, 5 분 에폭시 소량의 하단 얼굴 헥스 너트를 연결이 에폭시는 헥스 너트 또는 나사의 스레드에 들어갈 수없이 진수 너트의 가장자리 주위에 제외됩니다. 모든 모델링 흙이 제거되고 그것은 공백이 나사를 강화하여 굳게 장소에서 개최되는 수 있음을 확인합니다. </li></ol> 2. 해밀턴 펌프 및 stereotax : 맞춤 인젝터 배열에 대한 시스템을 준비 <ol><li> 연료 분사 장치 배열 시스템은 두뇌에 좌표 거의 모든 설정을 사용자 정의할 수 있습니다. </li><li> 사용자 첫째 찾습니다은 stereotax에서 사용하는 적절한 좌표로 변환, 마우스 (또는 다른 종) 뇌 아틀라스에서 원하는 사출 사이트의 좌표 (여기서, X -, Y - 및 Z - 좌표). 사출 사이트의 번호 (인물 1A 및 1B 세) 이하 K라는 것입니다. </li><li> 10 μl 해밀턴 주사기 K 번호는 같은 하버드 장치에서 하나로서 주입 / 탈퇴 주사기 펌프에 배치됩니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜빙의 다음 3 피트 길이의 조각은 안전하게 각 해밀턴 주사기 바늘에 첨부됩니다. </li><li> 폴리에틸렌 튜브, 업처치 과학에서 F - 252 튜브 슬리브의 각 조각을위한 오픈 엔드 이상 하락하고 있으며 포함된 너트를 사용하여 P - 627 튜브 어댑터에 연결된 또한 업처치 과학에서 물미. </li></ol> 3. 사용자 정의 주입기 배열을 구축 <ol><li> 각 인젝터의 배열은 사용자가 선택되는 좌표의 집합으로 정의됩니다. 단, 번역 및 / 또는 회전에 따라 다릅니다 좌표의 집합에 대해 같은 인젝터 배열을 사용할 수 있습니다. </li><li> 오직 상대 X 및 사출 사이트의 Y 좌표를 고려 K 구멍 &quot;이 같은 상대적인 간격으로.이 구멍이 Modela 미니 공장과 0.011를 사용하여 몰락는&quot;두께 32분의 1의 PCB 킬로그램 보드로 뚫고 아르 맥마스터 - 카에서 드릴 비트 직경. 속보 또는 드릴 비트를 착용하지 않도록 책임의 느린 속도 (Z - 스피드)를 사용해야합니다. 방앗간에서 보드를 제거하기 전에, 사각형은 작은 하나를 입고 피하기 위해, 직경 32분의 1 &quot;의 큰 드릴 비트를 사용하여 작은 구멍 주위 몰락하는 미니 밀에 대한 코드가 쉽게 MATLAB을 사용하여 생성할 수 있습니다;. 샘플 코드는 다음과 같은 파일에 제공됩니다. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB 코드를 원하는 좌표에서 Modela 코드를 생성 </li><li> holes_ex.rml - 킬로그램 - 보드에 드릴링 링 패턴 (8 홀)에 대한 Modela 코드 </li><li> outline_ex.rml - 구멍 주위에 드릴링 사각형에 대한 Modela 코드 </li></ol></li><li> 245 μm의는 OD/100 μm의 내경 (ID) 융합 실리카 모세관 튜브, Polymicro 기술에서 사용할 수는 3 인치 조각 K 오브 번호로 절단됩니다. 이들은 각각의 인젝터를 구성. 모세관 튜브의 일회용 조각을 통해 찌르고있다구멍의 각, 실제 인젝터를 괴롭히는없이 파편을 치워 수 있습니다. 인젝터는 다음 각 구멍에 중간 삽입, 그들이 서로 밀접하게 병렬 개최하고 있습니다 있도록. 인젝터는 연료 분사 장치를 배열의 구조를 형성, 이사회에 epoxied 있습니다. 유지 모든 올바른 길이로 인젝터를 장식하는 것입니다. </li><li> 연료 분사 장치를 배열은 stereotaxic 클램프의 나사를 강화하여 다음 아크릴 사각형 사이의 킬로그램 - 보드 중 하나가 모서리를 배치하여 stereotaxic 클램프에 연결하고 있습니다. 다음, 클램프의 금속 정맥은 stereotax의 부착 메커니즘을 사용하여 stereotax에 첨부되어 있습니다. </li><li> 다음 중 모든 현미경으로 이루어집니다. 외부 인젝터 (즉, 다른 인젝터의 부딪히는없이 스트레이트 에지와 함께 측면에서 접근할 수있는 하나) 중 하나, 킬로그램 보드의 하단 넘어 연장 끝 가위로 절단됩니다. 피질 주사 들어, 인젝터는 킬로그램 기판의 표면을 넘어 약 5mm 연장하도록 적합합니다. 깊은 주사의 경우이 번호는 깊이 해당 증가에 의해 증가 수 있습니다. 팁는 Dremel 도구 평평합니다. 심도 정밀 덜 중요한 경우 인젝터 팁 또한, 막히는에 대한 추가 예방 조치로 각도로 지상 수 있습니다. </li><li> 다음 안정된 기준점이 stereotaxic 팔 범위 내에서 선택하고, 연료 분사 장치를 배열은 외부 주입기의 평평 끝에,이 참조 지점에되도록 이동합니다. </li><li> 두 번째 주입기가 해당 좌표와 함께 선택됩니다. 첫 번째와 두 번째 인젝터 좌표 사이의 높이에 상대적인 차이가 (Z - 방향)입니다 간주됩니다. 인젝터 배열이 상대 거리에 의한 Z의 축을 따라 이동됩니다. 두 번째 주입기는 두 번째 주입기의 끝은 기준점의 높이에서 이제 평평하고 있도록 손질하고 올바른 길이로 Dremeled입니다. 연료 분사 장치를 배열은 참조 지점으로 분사기 팁의 비교를 용이하게하는 X와 Y 방향으로 이동할 수 있습니다. </li><li> 트리밍의이 과정은 나머지 인젝터에 대해 반복됩니다. </li></ol> 4. 전체 시스템을 조립 <ol><li> stereotaxic 클램프 및 맞춤 인젝터 배열은 모두 이미 만들어진,이 부분이 필요합니다. </li><li> 각 인젝터의 백 엔드는 (손질되지 않은 끝), P - 235 너트와 업처치 과학에서 P - 200 물미를 사용하여 F - 240 튜브 슬리브 파란색으로 삽입 이미 연결된 스레드 어댑터에 연결되어 폴리에틸렌 튜브에 의해 해밀턴 펌프합니다. 제조 업체의 지침에 대한 자세한 내용은 상담을하실 수 있습니다. </li><li> 27 게이지 바늘을 사용하여 실리콘 오일은 전혀 공기 방울과 함께 전체 시스템 인젝터 팁에 해밀턴 주사기에서 가득 있도록 해밀턴 주사기의 뒷면에 주입합니다. </li><li> 해밀턴 주사기가 해밀​​턴 펌프에 다시 배치됩니다로서, 실리콘 오일의 가장 큰 가능한 볼륨이 주사기에 유지됩니다. </li><li> 실험은 펌프가 (이 경우 두)을 위해 설계보다 더 주사기가 필요한 경우, 주사기는 한 다른 그들이 평행 유지하고, 모든 조각이되는 것을 보장하기 위해 플라스틱 작은 조각 (예 : 바늘 모자)과 간격 수 동일한 범위에 펌프에 의해 밀려. 또는 다중 랙 업그레 이드 키트는 한 10 주사기까지 개최 하버드 장치에서 구입하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 주사 / 수술 <ol><li> 병렬 주입기로 주입의 과정은 하나의 피펫과 주입의 매우 유사합니다. </li><li> 빠른 펌핑은 크고 작은 튜브 사이의 공동에 대한 스트레스를 넣어 있기 때문에 그것은 천천히 리필을 사용하여 /이 과정에서 속도를 달이다하는 것이 필수적입니다. 추천 최대 속도 : 2 μl / 바이러스를로드하는 분, 그리고 0.1 μl / 바이러스를 일으키는위한 분. </li><li> anesthetized 마우스는 stereotax에 배치하고, 실험을 통해 anesthetized 남아있다. </li><li> 필요에 따라 마우스를 준비합니다. 예를 들어, 메스와 싱글 컷이 눈 사이에서 귀 사이에, 피부의 정중선을 만들 수 있습니다. 피부는 두개골을 노출 다시 뽑아이며, 근막이 닦아 있습니다. 가져온 유리 피펫은 stereotax에 첨부되어 있습니다. bregma 및 람다가 같은 높이로 정렬하고, 그래서 그들을 연결하는 라인이 stereotax의 Y 축 평행 것을 때까지 귀 바의 위치가 조정됩니다. stereotax의 축의는 사출 좌표 계산되었습니다있는 좌표계에 따라 지향하고 있습니다. stereotaxic는 bregma에 유리 피펫의 끝에와 제로는 다음 팁을는 X 및 사출 사이트 중 하나의 Y - 좌표에서 약간 두개골 위에 위치합니다. </li><li> 뼈의 매우 얇은 층이 남아 때까지 치과 드릴을 사용하여, 팁 아래의 두개골은 신중하게 멀리 앞에 서있다. 유리 피펫 낮은 수몰락하는 구멍이 올바른 위치에 중심 있는지 확인하기 위해 제기 에드합니다. 30 게이지 바늘을 사용하여 레이어의 작은 조각이 부드럽게 올바른 X -와 Y - 좌표에서, 개털되도록 두라 메이터가 노출되는. 이 구멍은 인젝터 (0.25mm 폭) 중 하나에 맞게 충분 커야합니다. 다이어그램 그림 1D를 참조하십시오. 이 방법에서는 작은 0.25mm 넓은 구멍에서 두개골에 만든 X - 각 주사 사이트에 해당하는 Y는 - 좌표. </li><li> 유리 피펫은 샵스 컨테이너에서 삭제되고 맞춤화된 인젝터 배열은 stereotaxic 클램프를 사용하여 stereotax에 첨부되어 있습니다. </li><li> 제대로 주입기 배열의 각도를 설정하려면 두 외부 인젝터는 다음과 같이 주어진 참조 지점으로 조정하는 선택입니다. 인젝터 중 하나가 참조 지점과 일치하면, 상대 X -이 인젝터에 상대적인 사출 사이트간에 Y - 거리와 다른 하나를 고려하십시오. 전체 주입기 배열이 이러한 상대적인 거리에 의해 X -와 Y - 방향으로 이동되도록 stereotax의 축이 조정됩니다. 두 번째 주입기 이제 기준점에 부합하지 않으면, 금속 정맥은 느슨하게하고 회전합니다. 인젝터 배열이 올바르게 직각 때까지이 과정은 반복 반복됩니다. </li><li> 주사기가 2 μl 점 (이상)에까지 바이러스와 인젝터를 작성하기 전에, 인젝터는 실리콘 오일로 가득합니다. 이것은 제보에 막히는 모든 공기 방울 또는 쉽게로 이전 묘사, 주사기의 뒷면에서 실리콘 오일과 리필로 전체 시스템을하지 않고, 해밀턴 펌프를 사용하여 앞으로 기름을 추진하여 제거할 수 있도록, 버퍼 영역을 제공합니다. </li><li> Parafilm의 살균 조각은 두개골에 위치하며, 인젝터는 부드럽게 Parafilm에 가만히있어. 크게 다양한 깊이, 맞춤 가공된 부분 (예 : 계단 모양의 객체)로 좌표 로딩 용이하게 수 있습니다. </li><li> 다음 부품은 바이러스 1 μl이 (작은 수량이 원하는 경우에는 다음과 같은 수량이 크기를 줄일 수 함) 각 사이트에서 로드할 수 있다고 가정합니다. 바이러스&gt; 1 μl를 각 사이트에서 주입 것을 보장하기 위하여, 바이러스의 1.5 μl은 각 인젝터의 끝에 Parafilm이나 계단에 pipetted입니다. </li><li> 해밀턴 펌프의 리필 속도 1 μl / 분 설정으로 바이러스 1.2 μl은 각 인젝터로 리필됩니다. </li><li> 가장 긴 주입기의 끝은 bregma에서 제로이며, 다음 인젝터 배열은 그 주입기의 X 및 Y - 좌표 이동합니다. 막히는가 문제가있다면 많은 깊은 대상이 참여하는 경우, 말씀 :도 두뇌에 인젝터 팁 삽입하기 전에, 그것은 바이러스가 모든 인젝터 팁에서 신흥 볼 수 때까지 펌프 일으키는를 시작하는 때로는 권합니다. 이것은 인젝터 팁든지 공기 방울을 제거하고, 또한 더 괴롭히는가 없다는 것을 보장합니다. 막히는의 경우, 해밀턴 펌프는 부드럽게 막히는 아웃을 취소, 2 μl / 분 더 높은 속도로 짧은 펄스를 달이다으로 설정됩니다. </li><li> 연료 분사 장치를 배열은 다음 올바른 Z - 깊이, 30 게이지 바늘로 만든 작은 구멍을 통해 저하됩니다. </li><li> 바이러스 1 μl은 0.1 μl / 분, 각 인젝터를 통해 주입합니다. </li><li> 주사는 30 분 동안 혼자 남아 있습니다. </li><li> 연료 분사 장치를 배열 천천히 두뇌에서 추출되면 해밀턴 펌프는 각 인젝터에 막히는 것을 확인하기 위해, 0.1 μl / 분 같은 속도로 불어 넣다로 설정됩니다. </li><li> 다음 인젝터 2 μl / 분 에탄올 1.5 μl를 충진하고 일으키는 청소됩니다. </li><li> 마지막으로, 인젝터는 각 해밀턴 주사기에 2 μl 버퍼 영역을 유지하기 위해 실리콘 오일 리필 있습니다. </li><li> 모든 장비는 기관의 biosafety과 동물 사용 프로토콜에 따라, 절차 전후에 소독해야합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 개인 시간이 개업의 기술에 따라 달라집니다 있지만 병렬 인젝터의 배열은, 설치 및 복구 시간을 카운트 아니라, 인젝터의 숫자와 같은 요인에 의해 거의 수술을 속도. 1 microliter 주입을 위해, 우리는 일반적으로 직경 약 1mm (그림 1E)의 영역에 lentivirus 표현을 보았다. 분사의 정밀도 팁 위치의 다양성이 재판에서 재판에 대해 45 미크론 (끝 위치에서 의도 팁 위치로 거리의 표준 편차)가 그러한되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 트리플 병렬 인젝터 배열의 사진은 세 동시 주사 들어, 트리플 인젝터의 구성을 보여주는 병렬 인젝터 배열 시스템, 개략도. B, 디자인, 구현 및 병렬 바이러스 인젝터 배열을 사용하지 않습니다. diagrammed . <st롱&gt; C, 위에서 개요에 표시된 stereotaxic 클램프, D, 손상 - 최소화, 두뇌에 주입기 삽입을 위해 두개골에 구멍의 효율적인 개방을위한 기술의 그림 :. 치과 드릴, 얇은 다운 두개골 ~ 50 미크론의 두께로 다음 사용 channelrhodopsin - 2 (ChR2)를 보여주는 작은 craniotomy을 열 날카로운 바늘의 팁. E, 형광 이미지 GFP - 레이블로 트리플 인젝터 배열의 대상이 셋 마우스 대뇌 피질의 지역에서 세포가 B.에 표시

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

모든 절차는 실험 동물에 대한 NIH 가이드에 따라되었으며 MIT 동물 관리 및 사용 Biosafety위원회의 승인을.

(예 : 1,4,5,6,7,8 빛을 짧은 펄스에 대한 응답으로, temporally - 정밀한 방식으로 최근에는 유전자 인코딩 광학 sensitizers의 숫자가 활성화되는 뉴런을 활성화하고 생체내의 침묵 , 11). 뉴런은 포유류의 두뇌에 빛을 sensitized있다있는 주요 방법은,에서 마우스에서 원숭이에 이르기까지 동물의 두뇌에 opsins에 대한 인코딩 유전자를 제공할 수있는 등 lentiviruses 및 adeno - 관련 바이러스 (AAV)와 같은 바이러스를 통해이다 안전하고 지속 패션 (예 : 2,9,10). 바이러스는 특히 쥐가 원숭이와 같은 유전자 모델 생물되지 않은 생물, 트렌스 제닉보다 빠른 처리 시간을 허용하고, opsins에 대한 유전자 변형 시나리오에서 가능하지 않을 수 있습니다 높은 표현 수준을 사용 수 있습니다. 여기서 우리는 하나의 수술 단계에서 전체 3 차원 뇌 구조가 virally 유전자를 타겟팅할 수 있도록 신속한 timescale에 만들 수있는 병렬 인젝터 배열, &quot;회로 수준 트렌스 제닉을&quot;보여줍니다. 연료 분사 장치를 배열은 polyimide / 융합 - 실리카에 피드를 각 각 드라이브 주사기 세트는 높은 압력 관용 커넥터를 통해 모세관 하나 이상의 변위 펌프로 구성됩니다. 모세 혈관은 크기이며, 다음 stereotactic 위치 보드를 지정 밀링에 의해 지정된 원하는 위치에 삽입, 따라서 바이러스 또는 다른 시약이 뇌 영역의 원하는 집합에 전달 될 수 있도록. 장치를 사용하려면, 외과 먼저 기름을 완전히 유체 서브 시스템을 가득 채우고 바이러스와 모세 혈관을 backfills, 삽입 두뇌에 장치 및 (&lt;0.1 ​​μL / 분) 천천히 시약을 infuses. 이 기술 (예 : 같은 행동을하는 동안 정확한 시간에 complexly 모양의 구조의 밀리초 - timescale 종료 (예 : 해마 등), redundantly 행위 수 있습니다 양자 구조의 temporally - 정밀 불활 성화와 같은 실험을 새로운 종류의 다양한 활성화됩니다 왼쪽과 오른쪽 편도) 및 위상 밖으로있는 두 지역을 운전 여러 개별 뇌 영역 (예,의 섭동 교차 지역 synchrony 각 지역 내의 활동에 따라 달라집니다 방법을 연구, 또는 일부를 입을 동안 지역으로 입력을 자극하는 ) 몇 가지 목표 중 어느 이러한 입력의 효과를 중재에 대한 중요 이해하기 위해서는 대상으로하고 있습니다. 영장류에서이 같은 큰 두뇌 들어있는 우리는 최근 광학 셀 타입의 특정 신경 활성화 3 behaviorally - 관련 분야에서 활동을 perturbing 것은 크고 복잡한 구조의 바이러스 라벨이 필요할 수 있습니다를 증명하고있다. 마약, neuromodulators, 신경 전달 물질, 심지어 세포 - - 두뇌의 복잡한 3 - D 패턴에 temporally - 정밀한 방식으로 우리는 병렬 인젝터 배열이 거의 모든 페이로드를 삽입하는 데 사용할 수 있습니다. 마지막으로, translational 관점에서 그것은 빠르게, 환자 맞춤형 유전자 치료 또는 약물 전달 장치가 빠르게 될 수도 있습니다 사용자 정의 - 설계 및 잠재적으로의 사용을 통해 pathologies 다양한위한 새로운 치료법을 지원, 각각의 뇌 형상에 맞게 가공 광학 제어 분자. 연료 분사 장치를 배열 양쪽 공간과 volumetrically, 정확하게 설계되었습니다. 에서 X 및 Y - 지시,이 인젝터는 서로 평행하게 개최되도록 인젝터를 맞게 충분 큰 구멍이있는, 저렴한 미니 밀을 사용하여 매우 정확하게 배치 구멍을 시추에 의해 성취, 그리고 정확한에 위치입니다. Z - 방향에서 인젝터는 stereotaxic 수술 자체의에 상응하는 정밀도 수준을 허용, stereotaxic 장치를 사용하여 손질하고 있습니다. 용적 정밀도 해밀턴 펌프의 정밀도뿐만 아니라 고압 액체 크로마 토그래피 (HPLC) 필드에서 적응 거의 제로 죽은 볼륨 커넥터에서 발생한다. 인젝터는 등 철강 cannulas과 같은 대안의 큰 벽 두께없이 강하고 그것이 압력을 받고 정확한 모양과 간격을 유지 충분한 강성이다 융합된 실리카 모세관 튜브에서 만들어집니다. 작은 수정을 쉽게 실험의 다양한 병렬 인젝터 배열을 적응 할 수 있습니다. 바이러 스나 미세한 간격의 작은 볼륨이 필요한 경우 예를 들어, 작은 모세관 튜브는 해당 작은 드릴 비트와 함께, 고용 수 있습니다. 미래의 장치는 (아마도 같은 장치가 자유롭게 이동하는 동물의 머리에 장착할 수 있도록)의 크기를 최소화하기 위해, 병렬 인젝터의 수를 증가, microfluidic 채널과 펌프를 활용 수 있습니다.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

신경 회로에 대한 우리의 이해 - 크게 빠른 속도로 복잡한 3 유전자를 타겟팅하는 기술을 이용하여 용이 될 - 그들이 보조하다 감각, 생각, 감정, 그리고 행동, 어떻게 그들이 신경 및 정신 장애에 손상이있는 계산을 중재하는 방법 - 의 빠른 생성 활성화 차원 신경 회로, &quot;회로 수준 트렌스 제닉을.&quot; 우리는 최근에 빛에 민감한 단백질에 대한 바이러스 인코딩 밀리초 - timescale 활성화 특정 세포 유형을 감광성을하고 그대로 머리에 입을 수있는 방법을 개발했습니다. 우리는 여기에서 뇌의 3 차원 구조 내에서 정의된 포인트 수십하는 바이러스를 (또는 다른 유체) 제공 가능한 인젝터 배열의 설계 및 구현을 제시 (<strong&gt; 그림. 1A, 1B</strong&gt;). 연료 분사 장치를 배열은 polyimide / 융합 - 실리카에 피드를 각 각 드라이브 주사기 세트는 높은 압력 관용 커넥터를 통해 모세관 하나 이상의 변위 펌프로 구성됩니다. 모세 혈관은 크기이며, 다음 stereotactic 위치 보드를 지정 밀링에 의해 지정된 원하는 위치에 삽입, 따라서 바이러스 또는 다른 시약이 뇌 영역의 원하는 집합에 전달 될 수 있도록. 장치를 사용하려면, 외과 먼저 기름을 완전히 유체 서브 시스템을 가득 채우고 바이러스와 모세 혈관을 backfills, 삽입 두뇌에 장치 및 (&lt;0.1 ​​microliters / 분) 천천히 시약을 infuses. 연료 분사 장치를 배열의 병렬 특성은 가벼운 활성화 및 정의 뇌 회로의 입을를 활성화하기 위해 광학 sensitizers 같은 바이러스성 payloads과 전체 신경 회로의 신속 정확하고 안정적​​인 라벨을 용이하게합니다. 같은 뇌 영역의 원하는 세트 조명 납품을위한 광섬유 어레이와 같은 다른 기술과 함께, 우리는 그대로 머리에 인과 신경 기능의 탐색 체계를 수있는 도구 상자를 만들 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 이 기술은 포유류의 회로에 초점을 맞춘 신경 과학 이러한 체계적인 접근을 열고 같은 비 인간 영장류와 같은 큰 동물의 뇌 영역의 라벨 촉진뿐만 아니라 셀 - 특정 광 제어 prosthetics에 대한 임상 translational 경로를 열 수 없습니다 있습니다 누구의 정밀도는 어려운 뇌 질환의 개선 치료를 가능하게 수 있습니다. 마지막으로, 여기에서 설명한 같은 장치가 원활히 수 있습니다 정확하게 - 초과 쉽게 사용자 정의 방식으로 3 차원 구조 이러한 줄기 세포 및 약리 대리인 등 다른 payloads의 유체 전달,.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

신경 회로를 제어 및 분석<em&gt; 생체내에</em&gt; 뇌 영역의 원하는 3 차원 세트에 바이러스 및 기타 시약의 전달 기술에 의해 촉진됩니다. 우리는 복잡한 뇌 회로의 광학 조작을 지원, 사용자 정의 유체 인젝터 배열 제조 및 virally 인코딩된 광 sensitizers의 배달을 보여줍니다.

손상 3 - D 뇌 회로의 타겟팅 바이러스성을위한 확장 가능한 유체 인젝터 배열

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

연구

신경과학

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

뇌 이식 Microdevices과 주변 조직의 손상 조직 학적 특성

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 톡소 포자충</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

생리 학적으로 적합한 분석법을 사용하여 3 차원 줄기 세포 배양 물의 심문을위한 HiPSC 파생 혈청 무 세포 배아 체 개발

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

신경계 발달 중 축산 성장과 행동을 분석하는 3-D 콜라겐 기반 하이드로겔 생성

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...