Name: scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

ESB erkänner finansiering från NIH direktörens Nya Innovator Award (DP2 OD002002-01), NIH Challenge Grant 1RC1MH088182-01, NIH Grand möjligheter Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0.835.878 och 0.848.804), den McGovern institutet Neurotechnology Award Program , försvarsdepartementet, NARSAD, Alfred P. Sloan Foundation, Jerry och Marge Burnett, den SFN Research Award för innovation i neurovetenskap, MIT Media Lab, den Benesse Foundation och Wallace H. Coulter Foundation.

1. Konstruera Stereotaxic Clamp <ol><li> Den stereotaxic klämma används för att fästa injektorn arrayen till stereotax, så att spridarna är parallella med stereotaxic armen. </li><li> Varje lab behöver bara en klämma, om det förväntas att mer än en operation kan ske samtidigt. I detta fall gör samma nummer som den förväntade maximala antalet samtidiga operationer. Det kan också vara lämpligt att göra en extra, i händelse av skada på den första. </li><li> För att göra stereotaxic klämma, det första är en 1,5 mm ytterdiameter (OD) stål kanylen kapas till 2 inches i längd, och en av ändarna är Dremeled tills platt. </li><li> Nästa är en liten bit (ca 0,5 x 0,5 cm) skärs ut av PCB proto-styrelse, som ska användas som en spacer. </li><li> Med hjälp av en laser cutter att säkerställa att alla gjorde nedskärningar vinkelrätt mot ytan av materialet, är två identiska rektanglar (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) minskat från 1 / 8 &quot;akryl plåt, varje rektangel med två runda hål i motsatta hörn av rektangeln. Det första hålet har diameter 1,5 mm, och det är bara stor nog att rymma metallen kanylen ordentligt. Det andra hålet har diameter 1 / 16 &quot;(Figur 1C). </li><li> Metallen kanylen sätts in i 1,5 mm hål i en rektangel, sedan genom 1,5 mm hål i den andra. Den nedre änden av kanylen är i linje med botten inför den nedre rektangeln som bildar formen av en hockeyklubba. </li><li> Samtidigt som spacer tätt förrättas mellan de två rektanglarna är denna struktur cementeras ihop med hjälp av smältlim runt kanylen och 1,5 mm hål, var försiktig för att undvika att limma spacer till rektanglar. Modellera kan vara till hjälp för att hålla saker tillsammans under denna process. </li><li> När limmet har torkat, är en 1-72 skruv in i 1 / 16 hål från ovansidan av rektanglar. Sedan en 1-72 muttern skruvas fast i slutet av 1-72 skruven och åtdragna. Den skruv och mutter tjänar till att hålla klämma ihop. </li><li> För att fästa muttern i botten inför den nedre rektangeln, små mängder av 5-minuters epoxy släpps runt kanten på muttern, utan att epoxin att komma in i gängorna på muttern eller skruven. Varje modellera tas bort, och det bekräftas att spacer kan hållas stadigt på plats genom att dra åt skruven. </li></ol> 2. Förbereda systemet för skräddarsydda injektor array: Hamilton pump och stereotax <ol><li> Injektorn array-system kan anpassas till praktiskt taget alla uppsättning koordinater i hjärnan. </li><li> Användaren först lokaliserar koordinater för önskat injektionsställen i en mus (eller andra arter) hjärnan atlas, konvertera till rätt koordinater som används av stereotax (här, X-, Y-och Z-koordinater). Det antal injektionsställen (tre i figur 1a och 1b) kommer hädanefter att kallas K. </li><li> k antal 10 l Hamilton sprutor läggs i en injektion / återkallelse sprutpump som denna från Harvard apparater. </li><li> Nästa, tre fot långa bitar av polyeten slang är ordentligt ansluten till nålen varje Hamilton spruta. </li><li> För varje del av polyeten slang, en F-252 rör ärm från Upchurch Scientific är gled över den öppna änden och fäst vid en P-627 slang adaptern med den medföljande muttern och holk, också från Upchurch Scientific. </li></ol> 3. Konstruera Anpassade Injector Array <ol><li> Varje injektor array är anpassat till den uppsättning koordinater som användaren väljer. Men för uppsättningar koordinater som skiljer sig endast av en översättning och / eller rotation, kan samma injektor array användas. </li><li> Med tanke bara den relativa X-och Y-koordinater för injektionsställen är k hål borrade i en PCB proto-styrelsen i tjocklek 1 / 32 &quot;, med samma relativa avstånd. Dessa hål borras med hjälp av en Modela mini-kvarn och en 0,011&quot; diameter borr från McMaster-Carr. Var noga med att använda en långsam borrning (Z-hastighet) för att undvika att bryta eller slits ut borren. Innan du tar bort kortet från bruket, är en rektangel borras runt små hål, med en större borr med en diameter 1 / 32 &quot;, för att undvika att slita ut den mindre koden för mini-kvarnen kan genereras enkelt med hjälp av MATLAB;. Prov koden finns i följande filer. <ol class="lroman"><li> generate.m - MATLAB-kod för att generera Modela koden från önskade koordinater </li><li> holes_ex.rml - Modela kod för borrning ringsignal (åtta hål) i Proto-board </li><li> outline_ex.rml - Modela kod för att borra rektangel runt hål </li></ol></li><li> 245 ìm OD/100 ìm innerdiameter (ID) kvarts kapillär slangar, tillgänglig från Polymicro Technologies, är skuren i k antal 3 cm bitar. Dessa består av de enskilda spridare. En disponibla bit av kapillär slangar stack igenomvarje hål, för att rensa bort skräp utan att täppa själva spridare. Spridarna sedan in halvvägs in i varje hål, så att de hålls tätt och parallellt med varandra. Spridarna är epoxied till styrelsen, som bildar strukturen i injektorn matrisen. Allt som återstår är att trimma spridare till rätt längd. </li><li> Injektorn arrayen är ansluten till stereotaxic klämman genom att placera ett hörn av proto-styrelsen mellan akryl rektanglar och sedan genom att dra åt skruven i stereotaxic klämman. Därefter är metallen kanylen i klämman bifogas stereotax, med hjälp av den bifogade filen mekanism stereotax. </li><li> Alla följande sker under ett mikroskop. För en av de yttre spridare (dvs en som kan närma sig från sidan med en rak kant, utan att stöta på någon av de andra spridare), är toppen sträcker sig utanför botten av proto-nedskärning med en sax. För kortikal injektioner, är det lämpligt att ha injektorn sträcker sig ca 5mm utanför ytan av proto-styrelsen. För djupare injektioner, kan detta antal ökas med motsvarande ökning på djupet. Tipset är tillplattad med en Dremel-verktyg. Injector tips kan också vara marken i en vinkel som en extra försiktighetsåtgärd mot igensättning, om precision i djupet är mindre viktigt. </li><li> Nästa är en stabil referenspunkt som valts inom räckhåll för stereotaxic armen och injektorn rad flyttas så att den platta spetsen av den yttre injektorn är på denna referenspunkt. </li><li> En andra injektor väljs, tillsammans med motsvarande koordinater. Beaktas är den relativa skillnaden i höjd (z-riktning) mellan första och andra spridare koordinater. Injektorn array flyttas längs z-axeln genom denna relativa avstånd. Den andra injektor trimmas och Dremeled till rätt längd, så att spetsen på den andra injektorn är nu platt och på höjden av referenspunkten. Injektorn array kan flyttas i X-och Y-led för att underlätta jämförelse av injektorn spets med referenspunkten. </li><li> Denna process av trimning upprepas för de återstående spridare. </li></ol> 4. Montering av hela systemet <ol><li> Den stereotaxic klämma och kundanpassade injektor utbud, både redan byggda, krävs för denna del. </li><li> På baksidan slutet av varje injektor (slutet som inte har trimmat) sätts in i en blå F-240 rör ärm och med en P-235 mutter och P-200 holk från Upchurch Scientific, är knuten till den gängade adaptern redan är ansluten till Hamilton pumpen genom polyeten slang. Tillverkarens instruktioner kan konsulteras för information. </li><li> Med hjälp av en 27-nål är silikonolja injiceras i baksidan av Hamilton sprutor så att hela systemet är fyllt från Hamilton sprutan till injektorn spetsen, utan luftbubblor alls. </li><li> Som Hamilton sprutor är åter placeras i Hamilton pumpen, är den största möjliga mängd silikonolja bibehålls i sprutor. </li><li> Om försöket kräver mer sprutor än pumpen är avsedd för (två i detta fall) kan sprutor vara placerade med små bitar av plast (t.ex. nålskyddet) för att hålla dem parallellt med varandra och att säkerställa att alla bitar är skjuts av pumpen i samma utsträckning. Eller så kan en multi-rack uppgraderingskit köpas från Harvard apparater att hålla upp till 10 sprutor på en gång. </li></ol> 5. Injektioner / operation <ol><li> Processen att injicera med en parallell injektor är mycket lik den som injicera med en enda pipett. </li><li> Det är viktigt att använda långsamt fylla / ingjuta priser under hela denna process, eftersom snabb pumpning kan sätta stress på skarven mellan stora och små rör. Rekommenderad max hastighet: 2 l / min för lastning virus, och 0,1 l / min för infusion virus. </li><li> En sövda musen placeras i stereotax och förblir sövda under hela försöksperioden. </li><li> Förbered musen efter behov. Till exempel, med en skalpell, är ett enda snitt görs ner mittlinjen i huden, från mellan ögonen till mellan öronen. Huden dras tillbaka för att avslöja skallen, och fascia är avlägsnas. En drog glaspipett är knuten till stereotax. Positionerna i örat barer justeras tills bregma och lambda anpassas till samma höjd, och så att linjen mellan dem är parallell med Y-axel stereotax. Kärnpunkterna i det stereotax är orienterade enligt koordinatsystem i vilket injektion koordinater har beräknats. Den stereotaxic nollställs med spets glaspipett på bregma och sedan spetsen är placerad något över skallen på X-och Y-koordinater för en av injektionsställen. </li><li> Med hjälp av en Tandläkarborrmaskiner är skallen nedanför spetsen försiktigt fört bort tills det återstår ett extremt tunt lager av ben. Den glaspipett kan vara lägreED och uppvuxen för att kontrollera att hålet borras är centrerad på rätt plats. Med hjälp av en 30-gauge kanyl, är en liten bit av lagret försiktigt plockas bort, vid rätt X-och Y-koordinater, så att dura mater är utsatt för. Detta hål ska vara precis tillräckligt stor för att passa en av spridarna (0,25 mm bred). Se Figur 1D för diagrammet. På detta sätt är små, 0,25 mm breda hål i skallen, på X-och Y-koordinater som motsvarar varje injektionsställe. </li><li> Den glaspipett kastas i en avfallsbehållare, och anpassade injektorn arrayen är ansluten till stereotax med stereotaxic klämman. </li><li> För rätt att ställa in vinkel på injektorn matrisen, är två yttre spridare valt att vara kalibrerad för en given referenspunkt, enligt följande. Efter en av spridarna matchas med referenspunkten, anser den relativa X-och Y-avstånd mellan injektionsställe förhållande till denna injektor och en annan. Kärnpunkterna i det stereotax anpassas så att hela injektor rad flyttas i X-och Y-riktning av dessa relativa avstånd. Om den andra injektorn inte är nu i linje med referenspunkten är metallen kanylen lossnade och roteras. Denna process upprepas iterativt tills injektorn arrayen är vinklad på rätt sätt. </li><li> Innan du fyller injektorer med virus, är de spridare fyllda med silikonolja tills sprutorna är på 2 l punkt (eller högre). Detta ger en buffertzon, så att eventuella luftbubblor eller tilltäppning i spetsen lätt kan tas bort genom att trycka olja framåt med Hamilton pumpen, utan att behöva fylla på hela systemet med silikon olja från baksidan av sprutor, som beskriver tidigare. </li><li> En steril bit Parafilm placeras på skallen, och spridarna är försiktigt sänks ned på Parafilm. För koordinater med kraftigt varierande djup, en anpassad slipat en del (t.ex. en trappa-formade föremål) kan underlätta lastning. </li><li> Följande delar antar att 1 ìl av virus är att lastas på varje plats (följande mängder bör skalas ner om mindre mängder önskas). För att garantera att&gt; 1 ìl av virus injiceras på varje plats, är 1,5 l av virus pipetteras på Parafilm eller trappa på spetsen av varje insprutare. </li><li> Med påfyllning graden av Hamilton pumpen inställd på 1 l / min, är 1,2 l av viruset fyllas i varje injektor. </li><li> Spetsen på den längsta injektorn nollställs vid bregma och sedan injektorn arrayen är förskjutits till X-och Y-koordinater som spridare. Om igensättning är ett problem, säga om många djupa mål är inblandade: även innan du sätter i injektorn tips till hjärnan, är det ibland lämpligt att starta pumpen infusion, tills viruset kan ses fram från alla injektorn tips. Detta tar bort eventuella luftbubblor i injektorn tips, och dessutom ser till att det inte finns någon igensättning. Vid igensättning är Hamilton pumpen inställd på att ingjuta en kort puls vid en högre hastighet av 2 ml / min, för att försiktigt rensa ut igensättning. </li><li> Injektorn array är då sänks, genom de små hål som gjorts med 30-gauge nålar, till rätt Z-djup. </li><li> 1 ìl av virus injiceras genom varje injektor, på 0,1 l / min. </li><li> Injektionerna lämnas ensamma i 30 minuter. </li><li> Efter att injektorn arrayen är långsamt ur hjärnan, är Hamilton pumpen inställd på att ingjuta i samma takt på 0,1 l / min, för att kontrollera för igensättning i varje injektor. </li><li> Sedan spridarna rengörs genom att fylla och infusion av 1,5 l etanol vid 2 l / min. </li><li> Slutligen är spridarna fyllas med silikonolja för att hålla 2 l buffertzonen i varje Hamilton spruta. </li><li> All utrustning måste steriliseras före och efter ingreppet, enligt din institutions biosäkerhet och djur protokoll användning. </li></ol> 6. Representativa resultat Den parallella injektorn rad hastigheter upp en operation ungefär med en faktor som motsvarar antalet injektionsmissbrukare, inte räknar installation och återhämtning, även om enskilda gånger beror på skicklighet utövaren. För en 1 mikroliter injektion, såg vi vanligtvis lentivirus uttryck i en sfär av ungefär diametern 1 mm (figur 1E). Precisionen av injektionen var sådan att variationen i spetsen positionering, från försök till försök, var cirka 45 mikrometer (standardavvikelse av avståndet från spetsen position till den avsedda spetsen position). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figur 1" /> Figur 1. Design, implementering och användning av en parallell virus injektor array. A, schematisk av de parallella injektorn array-system som visar en trippel injektor konfiguration för tre samtidiga injektioner. B, fotografi av en trippel parallell injektor rad diagrammed som i en . <stRong&gt; C, stereotaxic klämma, som visas i kontur uppifrån D, illustration av teknik för effektiv, skador, minimera, öppna hål i skallen för injektor insättning i hjärnan:. med en dental drill, tunna skallen ner till ~ 50 mikrometer tjock, använd sedan spetsen på en vass nål för att öppna en liten kraniotomi. E, fluorescens bild som visar channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-märkta celler i tre mus kortikala regioner, som är målet för den trefaldiga injektorn samling visas i B.

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Alla förfaranden i enlighet med NIH Guide för försöksdjur och godkänts av MIT Animal skötsel och användning och biosäkerhet kommittéer.

Under senare år har ett antal genetiskt kodade optiska sensibiliserande aktiverat nervceller aktiveras och tystas in vivo i en tidsmässigt exakt som mode, som svar på korta ljuspulser (t ex 1,4,5,6,7,8 , 11). En viktig metod med vilken nervceller har varit känsliga för ljus i däggdjur hjärnan, är via virus som lentiviruses och Adeno-associerad virus (AAV), som kan leverera gener som kodar för opsins till hjärnan av djur, från möss till apor, i en säker och bestående sätt (t.ex. 2,9,10). Virus ger snabbare handläggningstid än vad transgena, särskilt för organismer som varken är genetisk modell organismer såsom råttor och apor, och för opsins kan möjliggöra höga uttryck nivåer som kanske inte är möjligt i transgena scenarier. Här visar vi en parallell injektor samling kan skapa, i en snabb tid &quot;, krets-nivå transgena&quot;, så hela 3-dimensionell hjärnstrukturer att viralt målinriktad med en gen i en enda operation steg. Injektorn utbud omfattar en eller flera deplacementpumpar att varje enhet en uppsättning av sprutor, som var och matar in en polyimid / kvarts kapillär via en högtrycks-toleranta kontakt. Kapillärerna är dimensionerade, och sedan in i, önskade platser anges av egen-fräsning en stereotaktisk placering ombord, vilket gör att virus eller andra reagenser som ska levereras till önskad uppsättning av hjärnan. För att använda enheten, fyller kirurgen först fluidic delsystem helt med olja, backfills kapillärerna med viruset, infogar den enheten i hjärnan, och ingjuter reagenser långsamt (&lt;0,1 ml / min). Denna teknik kommer att möjliggöra ett brett utbud av nya typer av experiment, som millisekund-tid avstängning av komplext formade strukturer (exempelvis hippocampus) vid exakta tider under beteende, tidsmässigt exakt som inaktivering av bilaterala strukturer som kan agera redundant (t.ex. vänster och höger amygdala), och den störning av flera diskreta hjärnan (t.ex. köra två sammanhängande områden i fas för att studera hur gränsöverskridande regionen synkronisering beror på aktiviteten inom varje region, eller stimulerande ingångar till en region, medan tysta en delmängd av målen för att förstå vilken av de olika målen är viktiga för att förmedla effekterna av dessa ingångar). För stora hjärnor som de i det primat, där vi har nyligen visat optisk cell-typspecifika neurala aktiveringen 3, störande verksamhet i ett beteendemässigt relevant område kan kräva virus-märkning av stora och komplexa strukturer. Vi noterar att parallellt injektor arrayer kan användas för att injicera nästan alla last - droger, neuromodulators, neurotransmittorer, eller ens celler - i komplexa 3D-mönster i hjärnan, i ett tidsmässigt-precist sätt. Slutligen, från en translationell synvinkel är det möjligt att snabbt, patient-anpassade genterapi eller droger enheter leverans kan snabbt skräddarsydda och tillverkade för att passa individuella hjärnan geometrier, stödja nya behandlingar för olika sjukdomar, eventuellt med hjälp av optisk kontroll molekyler. Injektorn arrayer är utformade för att vara exakt, både rumsligt och volymmässigt. I X-och Y-riktning, detta åstadkoms genom att borra mycket exakt placerade hål med en billig mini-kvarn, med hål precis stort nog för att passa spridarna, så att injektionsmissbrukare som hålls parallellt med varandra och på ett precist platsen. I Z-riktningen, är det spridare trimmas med hjälp av en stereotaxic apparat, så att en precision som motsvarar den stereotaxic operationen själv. Den volymetriska precisionen beror på precisionen hos Hamilton pump, liksom nära noll död volym kontakter, anpassat från högtrycks-vätskekromatografi (HPLC) fältet. Spridarna är tillverkade av kvarts kapillär slang, som är stark och styv nog att den håller exakt form och avstånd under tryck, utan att den större väggtjocklek av alternativ som stål kanyler. Små ändringar kan lätt göras för att anpassa parallellt injektorn arrayen till en mängd olika experiment. Till exempel, om en mindre mängd virus eller finare avstånd krävs, kan mindre kapillär slangar användas, tillsammans med en motsvarande mindre borr. Framtida enheter kan använda mikroflödessystem kanaler och pumpar för att öka antalet parallella spridare, för att minimera storleken (kanske möjliggör för denna utrustning skall monteras på cheferna för fritt rörliga djur).

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

Vår förståelse av neurala kretsar - hur de förmedlar de beräkningar som subserve känsla, tanke, känsla och handling, och hur de är skadade i neurologiska och psykiska störningar - kraftigt skulle underlättas av en teknik för att snabbt rikta gener till komplexa 3 - dimensionell neurala kretsar, vilket möjliggör snabb skapandet av &quot;krets-nivå transgena.&quot; Vi har nyligen utvecklat metoder där virus som kodar för ljuskänsliga proteiner kan medvetandegöra specifika celltyper till millisekund-tid aktivering och tysta i den intakta hjärnan. Vi presenterar här utformningen och genomförandet av en injektor rad kan leverera virus (eller andra vätskor) till dussintals definierade punkter inom de 3-dimensionella strukturen av hjärnan (<strong&gt; Figur. 1A, 1B</strong&gt;). Injektorn utbud omfattar en eller flera deplacementpumpar att varje enhet en uppsättning av sprutor, som var och matar in en polyimid / kvarts kapillär via en högtrycks-toleranta kontakt. Kapillärerna är dimensionerade, och sedan in i, önskade platser anges av egen-fräsning en stereotaktisk placering ombord, vilket gör att virus eller andra reagenser som ska levereras till önskad uppsättning av hjärnan. För att använda enheten, fyller kirurgen först fluidic delsystem helt med olja, backfills kapillärerna med viruset, infogar den enheten i hjärnan, och ingjuter reagenser långsamt (&lt;0,1 mikroliter / min). Den parallella typ av injektor utbud underlättar snabb, noggrann och robust märkning av hela nervbanor med viral nyttolaster som optiska allergiframkallande att ljus-aktivering och tysta definierat hjärnans kretsar. Tillsammans med andra tekniker, såsom optisk fiber matriser för lätta leverans till önskad uppsättningar av hjärnan, hoppas vi kunna skapa en verktygslåda som möjliggör systematiska utforskande av kausal neurala funktioner i den intakta hjärnan. Denna teknik kan inte bara öppna upp sådana systematiska metoder för att krets-fokuserad neurovetenskap hos däggdjur, och underlätta märkning av hjärnan i stora djur som icke-mänskliga primater, men kan också öppna upp en klinisk translationell väg för cell-specifik optisk kontroll protetik kanske vars precision möjliggöra bättre behandling av svårbemästrade sjukdomar i hjärnan. Slutligen kan sådana anordningar som beskrivs här underlättar exakt i tiden fluidic leverans av andra nyttolaster, såsom stamceller och farmakologiska agenter, till 3-dimensionella strukturer, i en lätt användaranpassad mode.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits at JoVE.com

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Styra och analysera neurala kretsar<em&gt; In vivo</em&gt; Skulle underlättas av en teknologi för leverans av virus och andra reagenser till önskad 3-dimensionella uppsättningar av hjärnan. Vi visar kundanpassade fluidic injektor utbud tillverkning och leverans av viralt-kodade optiska sensibiliserande, vilket gör optisk manipulering av komplexa hjärnan kretsar.

Skalbar fluidic Injektor arrayer för Viral Inriktning av intakt 3-D Brain Kretsar

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Inriktning av Deep Brain Strukturer med Microinjections för leverans av läkemedel, virala vektorer eller Transplantation Cell

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Intakt Histologisk karakterisering av Brain-implanterade Microdevices och omgivande vävnad

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiska inspelning i hjärnan i Intact vuxna zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

3-D Imaging och analys av nervceller Infekterade<em&gt; In Vivo</em&gt; Med<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Ändring av en Colliculo-thalamocortical Mouse Brain skiva, Införliva 3-D utskrift av avdelningen komponenter och Multi-skala optisk avbildning

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Gränssnitt 3D Engineered neuronala kulturer Micro-Elektrod arrayer: Ett innovativt<em&gt; In Vitro</em&gt; Experimentellt

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Utveckling av HiPSC-härledda serumfria embryoidorgan för undersökning av 3-D stamceller med användning av fysiologiskt relevanta analyser

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Att kombinera optogenetik med konstgjorda mikroRNA att karakterisera de effekter av genen Knockdown på presynaptiska funktion inom intakt neuronala kretsar

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Generation av 3-D kollagen-baserade Hydrogels att analysera Axonal tillväxt och beteende under nerv systemet utveckling

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...