Name: lentivirus production
Uploaded: 2009-10-02T21:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus Production at JoVE.com

<p class="jove_content"> Sandler Astma Basic Research Center (SABRE) <br /> Sandler Foundation </p>

<p class="jove_title"> Del 1: transfektion av HEK 293 celler att producera Lentiviruses </p><p class="jove_content"> * 24 timmar innan transfektion, platta 2,5 x 10 <sup>6</sup> celler i ett 10 cm skål för en confluency på 50-70% nästa dag. </p><ol><li> Starta detta protokoll genom att förbereda DNA som ett senare kommer transfektera en celler för att göra virus. Först, späd FuGENE 6 Roche Transfektion reagens, en lipid reagens som gör att cellerna tar upp DNA. I ett 1,5 ml rör, pipett 30μl FuGENE 6 i 600ul serumfritt medium (SFDMEM...

<ol>
	<li>Reiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+concentration+of+pseudotyped+HIV-1-based+gene+transfer+vectors..">Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors..</a> <em style='font-style: italic'>Gene Therapy</em>. , 72-7211 (2000).</li><li>Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>72</b> (11), 8463-8471 (1998).</li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM  HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry  pMDL pRSV pVSVG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bleach</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Clorox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>353003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Multichannel pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rainin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filtered pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rainin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-&mu;m)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue culture incubator at 5% CO<sub>2</sub></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beckman SW41T.I rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Beckman ultracentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FACS Array</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

lentivirus production

<p class="jove_content">RNA-interferens (RNAi) är ett system av geners uttryck i levande celler. I RNAi, gener homologa i ordning för att korta interfererande RNA (siRNA) är tystade på efter transkriptionella tillstånd. Kort hårnål RNA, prekursorer till siRNA, kan uttryckas med hjälp av lentivirus, vilket möjliggör RNAi i en mängd olika celltyper. Lentiviruses, såsom humant immunbristvirus, är kapabla att infektera både dela och icke-delande celler. Vi kommer att beskriva ett förfarande som att paketera lentiviruses. Förpackning syftar till att förbereda behöriga viruset från DNA-vektorer. Lentiviral vektor produktionssystem bygger på en &quot;split&quot; system, där det naturliga virala genomet har delats upp i enskilda hjälpare plasmid konstruktioner. Denna uppdelning av de olika virala element in i fyra separata vektorer minskar risken att skapa en replikering-kapabel virus genom oavsiktlig rekombination av Lentiviral genomet. Här är en vektor som innehåller shRNA av intresse och tre vektorer förpackning (p-VSVG, pRSV, pMDL) övergående transfekterade i människors 293 celler. Efter minst ett 48-timmars inkubationstid, viruset som innehåller supernatanten skördas och koncentrerad. Slutligen är virus titer bestäms av reportern (fluorescerande) uttryck med en flödescytometer.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Lentivirus Production at JoVE.com

Lentivirus Production

<p class="jove_content">För att göra lentiviruses, är DNA-vektorer transfekterade i människors 293 celler. Efter skörden och koncentrera supernatanten är virus titer bestäms av fluorescens uttryck med en flödescytometer.</p>

Lentivirus Produktion

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Tekniska Demonstration av hela genomet Array jämförande genomik hybridisering

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

Stora Sätt Miljö Genomic Bibliotek Produktion

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera humana med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Ett protokoll för produktion av KLRG1 tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Transduktion av mänskliga celler med polymer-komplexbundet Ecotropic lentivirus för förbättrade biosäkerhet

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in <em>Escherichia coli</em>

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grönt fluorescerande protein-baserad expressions Screening av membranproteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Production of Double-stranded DNA Ministrings

Produktion av dubbel DNA Ministrings

We constructed linear covalently closed (LCC) DNA minivectors as a non-viral gene-delivery vector alternative produced via a simple platform in vivo. DNA ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

Optimal lentivirus Produktion och cellodlingsbetingelser behövs för att framgångsrikt omvandla primära humana Bronkial epitelceller

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...