Name: use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity at JoVE.com

הוראות הכנה מאגר הדגירה, Buffer Assay, ו 0.6 פתרון N TCA מסופקים מוכן לשימוש פתרונות. המצע FITC-קזאין - מומלץ aliquot המצע FITC-קזאין לתוך נפח קטן יותר עם הגעתו, כדי למנוע חזרה להקפיא להפשיר מחזורים. אם המצע FITC-קזאין נתונה להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים, עלייה קלה ברקע יתרחש, ובכך להקטין את הרגישות. Aliquots צריך להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. מדגם כל, התגובה ריק, או לשלוט דורש 20 μl של המצע FITC-קזאין. הקפאה / הפשרה, כמו גם ערבוב נמרץ או רועד יכול לגרום FITC כדי להפריד בין קזאין שהתקבל ברקע גבוה קריאה גרימת המצע פחות להיות זמין עבור מחשוף פרוטאז. Isothiocyanate והעמסת (FITC), פתרון בקרת השליטה FITC ניתן מחדש של הצפת Assay לריכוז המתאים. פתרון זה צריך להיעשות טריים מוגן מפני אור. הפתרון הסופי הבקרה טריפסין - הוסף 100 μl של 1 mM HCl כדי בקבוקון של טריפסין, פרוטאז Control (קוד מוצר T 6567). מערבבים בקצרה, כדי להבטיח את טריפסין הוא מומס. הוסף 900 ​​μl של הצפת הדגירה ומערבבים היטב. לחלופין, מאגרים אחרים עשויים לשמש אם רוצים עבור assay. ריכוז העבודה הסופית של טריפסין הוא 20 מיקרוגרם / μl. כאשר מוכן להכין את פתרון בקרת טריפסין, לשלב aliquot הפתרון טריפסין חומצי עם כמות נכונה של הצפת הדגירה (1 acidified חלק טריפסין למאגר חלקי 9). אחסון טריפסין בתנאים חומצי מגביר את היציבות של טריפסין. הפתרון לשלוט טריפסין רגיש טמפרטורה אינו יציב בריכוזים נמוכים. נא לעיין בעלון הטכני של ערכת לאחסון והיציבות של הפתרונות הללו מוכנים. נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הכי קל להכין שולטת, החסר, ואת כל הדגימות בבת אחת. עבור כל מדגם הבדיקה, להוסיף 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl של מדגם הבדיקה לצינור microcentrifuge. לקבלת דוגמיות מבחן עם פעילות הפרוטאז גבוהה, דילול מדגם ייתכן שתידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות בקרה מתאימה (ראה דוגמאות הבקרה) על ידי הוספת 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl של המדגם שליטה צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם ריק ידי הוספת 20 μl של הצפת דגירה, 20 μl של המצע FITC-קזאין, ו 10 μl מים ultrapure לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות כל צינור לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 60 דקות. היזהר לא לערבב יותר מדי במרץ, כמו מערבולת מופרז עלול לגרום רקע הקרינה גבוהה להפחית את הרגישות של assay. הערה: זמן דגירה ניתן להאריך עד 24 שעות כדי להגביר את הרגישות. היזהר שלא יעלה על 24 שעות כמו FITC-קזאין עשויים להתחיל לבזות, המוביל רקע הקרינה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה להוסיף 150 μl הפתרון N 0.6 חומצה Trichloroacetic אל צינור כל microcentrifuge. TCA היא מאכל מאוד יש לטפל תוך לבישת ציוד מגן מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 10 דקות על 10,000 x ז Supernatant מכיל חומצה מסיסים, שברי שכותרתו FITC והוא משמש למדידת הקרינה. </li></ol> מדידות הקרינה שיטות אלה תשודרג כלפי מעלה או מטה בהתאם לדרישות של המכשור זמין. לשם השוואה עקומת סטנדרט מוכן עם דגימות בקרה מתאימה, לחסר הקריאה הקרינה של המדגם ריק (FLUblank) מהערך של מדגם הבדיקה (FLUtest). Cuvettes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של supernatant (שלב 7) ו - 1 מ&quot;ל של הצפת Assay לתוך קובט מתאים ומערבבים בעדינות. הערה: פתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר. </li></ol> Multiwell פלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של הערה supernatant (שלב 7) 1 מ&quot;ל של הצפת Assay לתוך צינור הבקבוקון מתאים או ומערבבים בעדינות: הפתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 μl לבאר צלחת 96 שחור טוב. רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר. או </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μl של supernatant (שלב 7) ו - 200 μl של B Assayuffer לבאר צלחת 96 שחור טוב. הערה: פתרון של הצפת supernatant ו Assay ניתן לאחסן בחושך ב 2-8 מעלות צלזיוס עד 24 שעות לפני מדידת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את עוצמת הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר וניטור אורך הגל פליטה של ​​535 ננומטר. </li></ol> בקרת דוגמאות פתרון בקרת טריפסין ניתן להשתמש כדי לאשר assay הוא מבצע כראוי, כדי לקבוע את גבול הגילוי, או ליצור עקומת סטנדרט כללי. עבור assay של פרוטאז אחר, ספציפי, מומלץ להכין פתרון בקרת המכיל את פרוטאז ספציפי למאגר הדגירה המתאים. גבול הגילוי של assay הוא כמות פרוטאז שמייצר קריאה הקרינה משמעותית מעל הערך שהושג עם המדגם ריק. גבול הגילוי ישתנה בהתאם הרגישות של המכשור. דילולים סידורי הפתרון בקרת טריפסין עשויים לשמש ליצירת פתרונות שליטה. שווה קריאה עד 120% מהשווי המתקבל עם המדגם ריק נחשב משמעותי. באופן שגרתי, הגבלה של גילוי של ng 5 של טריפסין התקבל עם הליך זה. מומלץ כי לפחות אחד 5 שליטת ng טריפסין להתנהל עם כל assay. פתרון בקרת טריפסין עם ריכוז של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​תגרום ng 5 הרצויה של טריפסין ב assay. דילול של פי 40 הפתרון בקרת טריפסין (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל) תוצאות בפתרון מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​0.5 שליטה, כלומר חלק אחד של פתרון בקרת טריפסין עד 39 חלקים של הצפת דגירה. <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 (Curve האחיד של פעילות טריפסין): הפתרון בקרת טריפסין (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עשוי לשמש גם כדי ליצור עקומת סטנדרט ידי ביצוע דילולים סדרתי (ראה איור 1). הקריאה הקרינה של המדגם כל פקד תוקנה על ידי הפחתת הקרינה קריאה של המדגם ריק (FLUblank) מהערך של המדגם כל פקד (FLUcontrol). עקומת סטנדרט אופיינית עבור טריפסין (קוד מוצר T 6567) באמצעות ערכת דגימות השליטה החל 0.15 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(ננוגרם 1.5) על 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(ננוגרם 25). עקומת הזה נוצר על ידי ביצוע ההליך המתואר, עם זמן דגירה של 30 דקות עבור לשלב 4. מדידות הקרינה שנעשו צלחת multiwell. Isothiocyanate והעמסת מסופק כביקורת לצורך כיול מכשיר אפשרי (ראו הוראות היצרן המתאים) או קביעת טווח הלינאריות של האות FITC.

<ol>
	<li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes.">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li></ol>

הכותב הוא עובד של סיגמא אולדריץ המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

הראינו רק assay למשל באמצעות ערכת פלורסנט פרוטאז איתור לזהות פעילות הפרוטאז במדגם ביולוגי. ערכה זו כבר אופטימיזציה לאתר מגוון רחב של פרוטאזות למצוא יישומים פיזיולוגיים. הוא מתאים לכל גילוי של ציסטאין סרין, Metallo ו פרוטאזות אספרטית, אולם שינויים עשויים להידרש לזהות כמה פרוטאזות ספציפיות.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments (optional)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PF0100|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Protease Fluorescent Detection Kit</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>PF0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H1758|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Hydrochloric Acid</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
</table>

use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מספק מוכן לשימוש ריאגנטים לגילוי נוכחות של פעילות הפרוטאז. Assay זה פשוט לזהות פעילות הפרוטאז משתמש שכותרתו קזאין כמו המצע עם isothiocyanate והעמסת (FITC). פעילות פרוטאז תוצאות המחשוף של המצע קזאין FITC שכותרתו לרסיסים קטנים, אשר אינם לזרז בתנאים חומציים. לאחר דגירה של המדגם פרוטאז ואת המצע, התגובה היא acidified עם תוספת של חומצה Trichloroacetic (TCA). התערובת היא centrifuged אז עם המצע מעוכלים להרכיב גלולה ואת קטנים, שברי מסיס חומצה שנותרו פתרון. Supernatant היא לנטרל את הקרינה של ה-FITC שכותרתו שברי נמדד. ההליך המתואר הערכה מזהה את השליטה הפרוטאז טריפסין בריכוז של כ 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(5 ng של טריפסין הוסיף assay). רגישות זו יכולה להיות מוגברת עם זמן דגירה ארוכה יותר, עד 24 שעות. Assay מתבצעת צינורות microcentrifuge והנהלים ניתנים לאיתור באמצעות פלואורסצנציה או cuvettes או צלחות multiwell.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity at JoVE.com

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

ערכת פלורסנט פרוטאז איתור מיועד למדידת פעילות הפרוטאז באמצעות fluorometry. זה מתאים גם זיהוי של כמויות זעירות של זיהום פרוטאז. השיטה מבוססת על hydroysis פרוטאוליטי של ניסוח קניינית של מצע קזאין FITC שכותרתו.

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק<sup&gt; 18</supמים&gt; O-מועשר

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

כתמים אימונוהיסטוכימיים פלואורסצנטיים מרובים של ארבעה סוגי תאי מערכת החיסון רירית הרחם בהפלה חוזרת ונשנית

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...