Name: use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity at JoVE.com

तैयार निर्देश ऊष्मायन बफर, परख बफर, और 0.6 एन TCA समाधान के लिए तैयार उपयोग के समाधान के रूप में प्रदान की जाती हैं. FITC - कैसिइन सब्सट्रेट - यह छोटी मात्रा में दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र से बचने के आगमन पर FITC - कैसिइन सब्सट्रेट विभाज्य करने के लिए सिफारिश की है. यदि FITC - कैसिइन सब्सट्रेट दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र के अधीन है, पृष्ठभूमि में एक मामूली वृद्धि होती है, जिससे, संवेदनशीलता कम. aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए और प्रकाश से सुरक्षित है. प्रत्येक नमूना, रिक्त, या नियंत्रण प्रतिक्रिया FITC - कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl की आवश्यकता है. रुक / के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पिघलना जोरदार मिश्रण या मिलाते FITC एक उच्च पृष्ठभूमि पढ़ने और कम सब्सट्रेट protease दरार के लिए उपलब्ध है के कारण में जिसके परिणामस्वरूप कैसिइन से अलग करने के लिए पैदा कर सकता है. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) नियंत्रण समाधान FITC नियंत्रण परख बफर में उचित एकाग्रता के लिए पुनर्गठित किया जा सकता है. यह समाधान ताजा किया जाना चाहिए और प्रकाश से रक्षा की. अंतिम trypsin नियंत्रण समाधान trypsin, Protease नियंत्रण (टी 6567 उत्पाद कोड) की शीशी 1 मिमी एचसीएल के 100 μl जोड़ें. संक्षिप्त मिक्स सुनिश्चित trypsin भंग कर रहा है. ऊष्मायन बफर के 900 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. वैकल्पिक रूप से, अन्य बफ़र्स अगर परख के लिए वांछित इस्तेमाल किया जा सकता है. trypsin के अंतिम कार्य एकाग्रता 20 μg / μl है. जब trypsin नियंत्रण समाधान तैयार करने के लिए तैयार, ऊष्मायन बफर (भाग 1 acidified 9 भागों बफर करने के लिए trypsin) की सही राशि के साथ अम्लीय trypsin समाधान के एक विभाज्य गठबंधन. अम्लीय शर्तों के तहत trypsin भंडारण trypsin की स्थिरता बढ़ जाती है. trypsin नियंत्रण समाधान तापमान संवेदनशील है और कम मात्रा में स्थिर नहीं है. किट इन तैयार समाधान के भंडारण और स्थिरता के लिए तकनीकी बुलेटिन की समीक्षा करें. प्रक्रिया <ol><li> यह आसान नियंत्रण, कारतूस, और नमूने एक समय में सब तैयार है. प्रत्येक नमूने के परीक्षण के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊष्मायन बफर के 20 μl, FITC कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl, और नमूने के परीक्षण 10 μl जोड़ें. उच्च protease गतिविधि के साथ परीक्षण के नमूने के लिए, नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकता है. </li><li> उचित नियंत्रण नमूने (नियंत्रण नमूने देखें) एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊष्मायन बफर, FITC कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl, और नियंत्रण नमूना के 10 μl के 20 μl जोड़कर तैयार करें. </li><li> एक microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊष्मायन बफर, FITC कैसिइन सब्सट्रेट के 20 μl, और ultrapure पानी की 10 μl के 20 μl जोड़कर एक खाली नमूना तैयार. </li><li> धीरे 37 ° 60 मिनट के लिए अंधेरे में सी पर प्रत्येक ट्यूब और सेते मिश्रण. भी सख्ती नहीं मिश्रण, के रूप में अत्यधिक अशांति उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि के कारण हो सकता है और परख की संवेदनशीलता को कम करने के लिए सावधान रहें. नोट: ऊष्मायन समय 24 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है संवेदनशीलता को बढ़ाने. 24 घंटे से अधिक नहीं के रूप FITC - कैसिइन को नीचा दिखाना शुरू कर सकते हैं सावधान रहो, उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि करने के लिए अग्रणी. </li><li> ऊष्मायन के बाद 0.6 एन Trichloroacetic एसिड प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब के लिए समाधान के 150 μl जोड़ें. TCA बहुत संक्षारक है और उचित सुरक्षा उपकरण पहने हुए नियंत्रित किया जाना चाहिए. </li><li> धीरे मिश्रण और 37 पर सेते ° सी 30 मिनट के लिए अंधेरे में. </li><li> 10,000 एक्स जी पर 10 मिनट के लिए ट्यूबों अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला अम्ल घुलनशील, FITC लेबल टुकड़े होते हैं और प्रतिदीप्ति माप के लिए इस्तेमाल किया जाता है. </li></ol> प्रतिदीप्ति माप इन तरीकों को बढ़ाया जा सकता है या नीचे उपलब्ध इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकताओं के अनुसार. उचित नियंत्रण के नमूनों के साथ एक मानक तैयार वक्र की तुलना के लिए, प्रत्येक नमूने के परीक्षण मान (FLUtest) से रिक्त नमूने (FLUblank) के प्रतिदीप्ति पढ़ने घटाना. Cuvettes <ol><li> पिपेट सतह पर तैरनेवाला (चरण 7) और एक उपयुक्त क्युवेट में परख बफर के 1 मिलीलीटर के 10 μl और धीरे मिश्रण. नोट: सतह पर तैरनेवाला और परख बफर के समाधान 2-8 ° सी में अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है 24 घंटे पहले प्रतिदीप्ति मापने के लिए. </li><li> उत्तेजना के साथ 485 एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और 535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की निगरानी. </li></ol> Multiwell प्लेट्स <ol><li> सतह पर तैरनेवाला (चरण 7) और एक उपयुक्त ट्यूब या शीशी में परख बफर की एक मिलीलीटर और धीरे मिश्रण के पिपेट 10 μl: सतह पर तैरनेवाला और परख बफर के समाधान 2-8 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में अप के लिए भंडारित किया जा सकता है प्रतिदीप्ति मापने से पहले 24 घंटे के लिए. </li><li> एक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से 200 μl स्थानांतरण. उत्तेजना के साथ 485 एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और 535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की निगरानी. या </li></ol><ol><li> पिपेट सतह पर तैरनेवाला के 2 μl (चरण 7) और परख बी के 200 μlएक काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के एक कुएँ में uffer. नोट: सतह पर तैरनेवाला और परख बफर के समाधान 2-8 ° सी में अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है 24 घंटे पहले प्रतिदीप्ति मापने के लिए. </li><li> उत्तेजना के साथ 485 एनएम प्रतिदीप्ति तीव्रता रिकार्ड और 535 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन की निगरानी. </li></ol> नियंत्रण नमूने Trypsin नियंत्रण समाधान पुष्टि परख ठीक से प्रदर्शन कर रहा है, पता लगाने सीमा निर्धारित करते हैं, या एक सामान्य मानक वक्र बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अलग, विशिष्ट protease की परख के लिए, यह एक नियंत्रण उचित ऊष्मायन बफर में विशिष्ट protease युक्त समाधान तैयार करने के लिए सिफारिश की है. परख का पता लगाने की सीमा protease की राशि है कि रिक्त नमूने के साथ प्राप्त मूल्य से ऊपर एक महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति पढ़ने का उत्पादन है. पता लगाने की सीमा इंस्ट्रूमेंटेशन के संवेदनशीलता के आधार पर अलग अलग होंगे. Trypsin नियंत्रण समाधान के सीरियल dilutions नियंत्रण समाधान उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक पढ़ने रिक्त नमूने के साथ प्राप्त मूल्य के 120% के बराबर महत्वपूर्ण माना जाता है. नियमित, trypsin के 5 एनजी का पता लगाने के की सीमा इस प्रक्रिया के साथ प्राप्त किया गया था. यह अनुशंसा की जाती है कि कम से कम 5 एनजी trypsin नियंत्रण प्रत्येक परख के साथ चला जा. 0.5 μg / एमएल के एक एकाग्रता के साथ एक trypsin नियंत्रण समाधान परख में वांछित trypsin के 5 एनजी पर नतीजा होगा. Trypsin नियंत्रण समाधान (20 μg / मिलीलीटर) एक 0.5 नियंत्रण / μg मिलीलीटर समाधान, यानी एक हिस्सा trypsin नियंत्रण ऊष्मायन बफर के 39 भागों के लिए समाधान के परिणामों में 40 गुना के एक कमजोर पड़ने. <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="चित्रा 1" /> चित्रा 1 (trypsin गतिविधि का मानक वक्र): trypsin नियंत्रण समाधान (20 μg / मिलीलीटर) भी धारावाहिक dilutions करके एक मानक वक्र उत्पन्न (चित्रा 1 देखें) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रत्येक नियंत्रण नमूने के प्रतिदीप्ति पढ़ने रिक्त नमूने के प्रत्येक नियंत्रण नमूने (FLUcontrol) के मूल्य से प्रतिदीप्ति (FLUblank) पढ़ने subtracting द्वारा सही किया गया था. Trypsin (उत्पाद कोड टी 6567) के लिए विशिष्ट मानक वक्र इस किट का उपयोग और नियंत्रण के नमूने 0.15 μg / एमएल (1.5 एनजी) से 2.5 μg / मिलीलीटर (25 एनजी) को लेकर. इस वक्र वर्णित प्रक्रिया का पालन करके चरण 4 के लिए 30 मिनट की एक ऊष्मायन समय के साथ उत्पन्न किया गया था. प्रतिदीप्ति माप एक multiwell थाली में किए गए थे. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट संभव साधन अंशांकन के लिए एक नियंत्रण (उपयुक्त है निर्माता के निर्देशों को देखें) या FITC संकेत के linearity रेंज के निर्धारण के रूप में प्रदान की जाती है.

<ol>
	<li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes.">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li></ol>

लेखक सिग्मा Aldrich के एक कर्मचारी है कि इस लेख में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों और उपकरणों का उत्पादन है.

हम सिर्फ एक उदाहरण परख दिखाया है Protease प्रतिदीप्त जांच किट का उपयोग करने के लिए एक जैविक नमूने में protease गतिविधि का पता लगाने. इस किट शारीरिक अनुप्रयोगों में पाया proteases की एक विविध रेंज का पता लगाने के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. यह सेरीन, सिस्टीन, metallo, और एसपारटिक proteases का पता लगाने के के लिए उपयुक्त है, तथापि, संशोधनों के कुछ विशिष्ट proteases का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है है.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments (optional)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PF0100|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Protease Fluorescent Detection Kit</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>PF0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H1758|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Hydrochloric Acid</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
</table>

use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity

Protease प्रतिदीप्त जांच किट प्रदान करता है तैयार उपयोग protease गतिविधि की उपस्थिति का पता लगाने के लिए अभिकर्मकों. Protease गतिविधि का पता लगाने के लिए यह सरल परख कैसिइन सब्सट्रेट के रूप में उपयोग करता है fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ लेबल है. FITC - छोटे टुकड़े, जो अम्लीय शर्तों के तहत नहीं वेग में लेबल कैसिइन सब्सट्रेट की दरार में protease गतिविधि का परिणाम है. Protease नमूना और सब्सट्रेट के ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया trichloroacetic एसिड (TCA) के अलावा के साथ acidified है. मिश्रण तो पचाया नहीं सब्सट्रेट एक गोली और छोटे, अम्ल घुलनशील समाधान में शेष टुकड़े के गठन के साथ centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला और निष्प्रभावी है FITC लेबल टुकड़े के प्रतिदीप्ति मापा जाता है. वर्णित किट प्रक्रिया लगभग 0.5 μg / एमएल (trypsin के 5 एनजी परख के लिए जोड़ा) के एक एकाग्रता में trypsin protease नियंत्रण का पता लगाता है. इस संवेदनशीलता एक लंबी ऊष्मायन समय के साथ वृद्धि हुई किया जा सकता है, 24 घंटे तक. परख microcentrifuge ट्यूबों में किया जाता है और प्रक्रियाओं प्रतिदीप्ति या तो cuvettes या multiwell प्लेटों का उपयोग कर पता लगाने के लिए प्रदान की जाती हैं.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity at JoVE.com

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Protease प्रतिदीप्त जांच किट protease गतिविधि की माप fluorometry का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. यह भी protease संदूषण की मात्रा का पता लगाने का पता लगाने के के लिए उपयुक्त है. विधि FITC लेबल कैसिइन सब्सट्रेट के एक मालिकाना सूत्रीकरण के proteolytic hydroysis पर आधारित है.

Protease प्रतिदीप्त जांच किट का प्रयोग Protease गतिविधि निर्धारित

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

गैर इनवेसिव पता लगाने के लिए प्रतिदीप्त रंगों के साथ ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ स्टेम सेल लेबल

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

कैसिइन के रूप में एक सब्सट्रेट - सिग्मा गैर विशिष्ट Protease गतिविधि परख

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

एनजाइम एसीटेट kinase की गतिविधि एसीटेट बनाने की सीधी जांच

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

माउस शुक्राणु cryopreservation और रिकवरी मैं · क्रायो किट का उपयोग

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Protease और एसिड उत्प्रेरित लेबलिंग रोजगार वर्कफ़्लोज़<sup18&gt;</sup&gt; हे समृद्ध जल

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Langerhans अलगाव के माउस आइलेट शुद्ध Collagenase और तटस्थ Protease का एक संयोजन का उपयोग

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

प्रतिदीप्ति Protease सुरक्षा का उपयोग झिल्ली प्रोटीन टोपोलॉजी निर्धारण (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

का उपयोग<em&gt; पूर्व विवो</em&gt; पूरे अंग इमेजिंग और मात्रात्मक ऊतक प्रोटोकॉल fluorescently लेबल अणु की जैव वितरण निर्धारित करने के लिए

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

स्तनपान डिहाइड्रोजनेज ज़ब्ती परख-एक सरल और विश्वसनीय विधि स्तनधारी कोशिकाओं में थोक Autophagic ज़ब्ती गतिविधि निर्धारित करने के लिए

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

आवर्ती गर्भपात में चार एंडोमेट्रियल इम्यून सेल प्रकारों के मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...