Name: use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity
Uploaded: 2009-08-04T16:40:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity at JoVE.com

Hazırlık Talimatı Kuluçka Tampon, Assay Tampon ve 0.6 N TCA Çözüm kullanıma hazır çözümler olarak sağlanmaktadır. FITC Kazein Yüzey tekrarlanan donma-çözülme döngüleri önlemek için vardıklarında küçük birimlere kısım FITC Kazein Yüzey tavsiye edilir. FITC Kazein Yüzey tekrarlanan donma-çözülme döngüsüne maruz kalırsa, arka planda hafif bir artış hassasiyet düşürücü, böylece meydana gelecektir. Alikotları, -20 ° C&#39;de saklanan ve ışıktan korunmalıdır. Her bir örnek, boş, ya da kontrol reaksiyon FITC Kazein Yüzey 20 ul gerektirir. Freeze / Çözülme yanı sıra kuvvetli karıştırma veya sallayarak FITC, okuma ve daha az substrat proteaz bölünme için kullanılabilir hale gelmesine neden yüksek bir arka plan ile sonuçlanan Kazein ayrı neden olabilir. Floresein izotiyosiyanat (FITC) Kontrol Çözüm Testi Tampon FITC kontrolü, uygun konsantrasyonda sulandırılmış olabilir. Bu çözüm, taze ve ışıktan korunmalıdır. Final tripsin Kontrol Çözümü - 1 mM HCl 100 ul tripsin, Proteaz Kontrolü (Ürün Kodu T 6567) flakon. Tripsin çözülmüş olduğundan emin olmak için kısa bir süre karıştırın. Kuluçka Tampon 900 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Alternatif olarak, eğer tahlil için istenen diğer tamponlar kullanılabilir. Tripsin son çalışma konsantrasyonu 20 mcg / ml. Tripsin Kontrol Çözüm hazırlamak için hazır olduğunuzda, bir kısım Kuluçka Buffer (9 parça tampon 1 yarı asitlendirilmiş tripsin) doğru miktarda asidik tripsin çözüm birleştirir. Tripsin asidik koşullar altında saklanması tripsin istikrarı artırır. Tripsin kontrol çözümü ısıya duyarlı ve düşük konsantrasyonlarda sabit değildir. Hazırlanan bu çözümler depolama ve istikrarı için kit teknik bülten gözden geçirin. Prosedür <ol><li> Bir kerede tüm kontrolleri, boşlukları ve numuneleri hazırlamak için en kolayıdır. Her bir test örneği için, bir mikrosantrifüj tüp 20 ul Kuluçka Buffer, 20 ul FITC Kazein Yüzey ve test örneği 10 ul ekleyin. Yüksek proteaz aktivitesi test örnekleri, örnek seyreltme gerekebilir. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp 20 Kuluçka Tampon, 20 ul FITC Kazein Yüzey ve kontrol örneği 10 ul ul ekleyerek uygun kontrol örneklerinde (Kontrol Örnekler) hazırlayın. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüp 20 Kuluçka Tampon, 20 ul FITC Kazein Yüzey ve ultra saf su 10 ul ul ekleyerek boş bir örnek hazırlayın. </li><li> Her bir tüp ve inkübe 37 ° C&#39;de 60 dakika süreyle karanlıkta yavaşça karıştırınız. Türbülansı yüksek floresan arka plan neden olabilir, çok güçlü bir şekilde karıştırın ve testin duyarlılığını azaltmak için dikkatli olun. Not: İnkübasyon süresi duyarlılığını artırmak için 24 saate kadar uzatılabilir. Yüksek floresan arka önde gelen, 24 saat FITC-Kazein düşmeye başlayabilir aşmayacak şekilde dikkatli olun. </li><li> Inkübasyondan sonra her mikrosantrifüj tüpe 0,6 N Trikloroasetik Asit Çözeltisi 150 ul ekleyin. TCA çok aşındırıcı ve uygun koruyucu ekipman giyerek ele alınmalıdır. </li><li> 37 ° hafifçe karıştırın ve inkübe ° C de 30 dakika süreyle karanlıkta. </li><li> 10.000 x g. az 10 dakika süreyle tüpleri Santrifüj Süpernatant asit çözünür, FITC etiketli parçaları içeren ve floresan ölçümü için kullanılır. </li></ol> Floresan Ölçümler Bu yöntemler ölçekli veya aşağı enstrümantasyon mevcut şartlara göre olabilir. Uygun kontrol örnekleri ile hazırlanan standart eğri karşılaştırma için, her bir test örneği değeri (FLUtest) boş bir örneği (FLUblank) floresan okuma çıkarın. Hendekler <ol><li> Pipet 10 süpernatant (adım 7) ve uygun bir küvet içine Testi Tampon 1 ml ul ve hafifçe karıştırın. Not: süpernatant ve Analiz Tampon çözüm floresan ölçüm önce 24 saate kadar 2-8 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li><li> 485 nm eksitasyon ile floresan kaydetme ve izleme emisyon dalga boyu 535 nm. </li></ol> Multiwell Tabaklar <ol><li> Pipet 10 ul supernatant (adım 7) ve uygun bir tüp veya şişenin içine Testi Tampon 1 ml ve hafifçe karıştırın Not: süpernatant ve Analiz Tampon çözüm, 2-8 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir floresan ölçüm 24 saat önce için. </li><li> Siyah 96 plaka iyi 200 ul aktarın. 485 nm eksitasyon ile floresan kaydetme ve izleme emisyon dalga boyu 535 nm. Veya </li></ol><ol><li> Pipet süpernatantı 2 ul (adım 7) ve Test B 200 ulsiyah 96 plaka bir kuyuya uffer. Not: süpernatant ve Analiz Tampon çözüm floresan ölçüm önce 24 saate kadar 2-8 ° C&#39;de karanlıkta saklanabilir. </li><li> 485 nm eksitasyon ile floresan kaydetme ve izleme emisyon dalga boyu 535 nm. </li></ol> Kontrol Örnekleri Tripsin Kontrol Çözüm tahlil saptama sınırı belirlemek, ya da genel bir standart eğri oluşturmak için, düzgün gerçekleştirirken onaylamak için kullanılabilir. Farklı, özel bir proteaz testi için, uygun inkübasyon tamponunda proteaz içeren bir kontrol solüsyonu hazırlamak için tavsiye edilir. Testin algılama limiti, boş bir örneği ile elde edilen değerin üzerinde önemli bir floresan okuma üretir proteaz miktarı. Algılama sınırı enstrümantasyon hassasiyetine bağlı olarak değişir. Tripsin Kontrol Çözüm Seri dilüsyonları kontrol çözümleri oluşturmak için kullanılan olabilir. Boş bir örneği ile elde edilen değerin% 120 okuma eşit olarak anlamlı kabul edildi. Rutin, tripsin 5 ng algılama sınırı Bu işlem ile elde edildi. Her deney en az bir 5 ng tripsin kontrolü ile çalıştırmak olması tavsiye edilir. 0.5 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon ile tripsin kontrol çözümü tayininde tripsin istenen 5 ng neden olacaktır. Tripsin Kontrol Çözümü (20 mg / ml) 0.5 mg / ml kontrol çözümü, yani bir parçası Kuluçka Tampon 39 parça tripsin Kontrol Çözüm sonuçları 40 kat seyreltme. <img src="/files/ftp_upload/1514/figure1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 (tripsin Faaliyet Standart Eğrisi): tripsin Kontrol Çözümü (20 mg / ml) (bkz. Şekil 1) seri dilüsyonları yaparak standart bir eğri oluşturmak için kullanılır. Her bir kontrol örneği floresan okuma boş örnek floresan okuma (FLUblank) her kontrol örneği (FLUcontrol) değeri çıkarılarak giderilmiştir. 0.15 mcg / ml (1.5 ng) 2.5 mg / ml (25 ng) arasında değişen bu seti ve kontrol örnekleri kullanarak tripsin (Ürün Kodu T 6567) için tipik bir standart eğri. Bu eğri açıklanan prosedürü izleyerek, adım 4 için 30 dakikalık bir inkübasyon süresi oluşturulmuştur. Multiwell plaka Floresan ölçümleri yapıldı. Floresein izotiyosiyanat mümkün alet kalibrasyon kontrolü (uygun üreticinin talimatlarına bakınız) veya FITC sinyal doğrusallık aralığı belirlenmesi sağlanır.

<ol>
	<li>Twining, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Casein+Assay+for+Proteolytic+Enzymes.">Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Casein Assay for Proteolytic Enzymes.</a> Anal. Biochem. 143, 30-34 (1984).</li></ol>

Yazar, bu yazıda kullanılan reaktifler ve araçları üreten Sigma Aldrich bir çalışanı.

Biz sadece biyolojik bir örnek proteaz aktivitesi tespit etmek için Proteaz Floresan Algılama Kit kullanarak bir örnek tahlil göstermiştir. Bu kit, çok çeşitli fizyolojik uygulamalarda bulundu proteazlar tespit etmek için optimize edilmiştir. Serin, sistein, metalli ve aspartik proteazlar tespiti için uygundur, ancak yapılan değişiklikler bazı spesifik proteazlar algılamak için gerekli olabilir.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments (optional)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PF0100|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Protease Fluorescent Detection Kit</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>PF0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H1758|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Hydrochloric Acid</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
</table>

use of the protease fluorescent detection kit to determine protease activity

Proteaz Floresan Algılama Seti sağlamaktadır hazır proteaz aktivitesi varlığını tespit için kullanımı reaktifler. Bu basit bir tahlil proteaz aktivitesi tespit etmek için kazeinin, substrat olarak floresein izotiyosiyanat (FITC) ile etiketlenmiş kullanır. Proteaz aktivitesi asidik koşullar altında çökelek değil küçük parçaları, içine FITC etiketli kazein substrat bölünme ile sonuçlanır. Proteaz örnek ve yüzey inkübasyondan sonra, reaksiyon trikloroasetik asit (TCA) eklenmesi ile asitlendirilmiş. Bu karışım daha sonra bir pelet ve çözelti içinde kalan küçük, asit çözünür parçaları oluşturan sindirilmemiş substratı ile santrifüj edilir. Süpernatant nötralize edilir ve FITC etiketli parçaları floresan ölçülür. Açıklanan kiti prosedür yaklaşık 0.5 mg / ml (tripsin 5 ng tahlil eklenen) bir konsantrasyon tripsin proteaz kontrol algılar. Bu duyarlılık, daha uzun bir kuluçka süresi, 24 saate kadar artırılabilir. Mikrosantrifüj tüpler tahlil yapılır ve prosedürleri Küvet veya multiwell plakaları kullanarak floresan tespiti için verilmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity at JoVE.com

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Sigma&#39;nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Enzim Asetat Kinaz Asetat oluşturan Faaliyet Doğrudan Algılama

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the IÃƒâ€šÃ‚Â·Cryo Kit

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Istihdam Proteaz-ve Asit-katalizli Etiketleme İş Akışları<sup&gt; 18</sup&gt; O-zenginleştirilmiş Su

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay ÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Tekrarlayan Düşükte Dört Endometriyal İmmün Hücre Tipinin Çok Yönlü Floresan İmmünohistokimyasal Boyanması

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...