Name: preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation at JoVE.com

Lens epitel eksplant hazırlanması Dr John McAvoy 9 laboratuvar kökenli yöntemler adapte edilmiştir. Bu çalışma, İntramural Araştırma Programı Z01-EY000238-22 Ulusal Göz Enstitüsü tarafından finanse edilmektedir

Bölüm 1: lenslerin kaldırılması Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Mikro-diseksiyon makas, eğri, künt ipuçları, (böyle as.RS-5983, Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD); mikro diseksiyon cımbız, kavisli ucu (Roboz # RS5137 gibi). </li><li> Süspansiyon orta: Orta 199, 100 ünite sığır serum, albumin / ml penisilin% 0.1, 100μg/ml streptomisin, 2.5 mikrogram / ml Amfoterisin B Reaktifler içeren Invitrogen, Carlsbad, CA mevcuttur. </li></ol> Prosedür: <ol><li> National Institutes of Health, Bethesda, MD tarafından sağlanan yönergelere uygun olarak yeni doğan ratlarda Euthanize (2-4 gün arası). </li><li> Cerrahi makas ile göz kapaklarını çıkarın. Dışarıya doğru çıkıntı göz zorlamak için göz soket ters tarafta kavisli cımbız ile hafifçe basın. Makas ile gözün arka tarafında küçük bir kesi olun. Kesi karşısında göz kenarına cımbız ile basarak, lens ve bağlı vitreus küçük bir miktar daha sonra objektif kıvrımlı cımbız ile alınır sağlayan, rüptür sonucu zorla olabilir. Bakım lens kapsül kırmak için değil alınmalıdır. </li><li> 5ml sıcak, steril süspansiyon orta içeren bir 60mm plastik doku kültürü çanak lensler aktarmak için kavisli bir cımbız kullanın. </li></ol> Bölüm 2: eksplant Mikrodisseksiyon Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Mikro Diseksiyon cımbız, 0,1 mm ipuçları, (Roboz RS-4976 gibi). Biz çünkü ucu esneklik Dumostar alaşım kullanabilirsiniz, ancak diğer çelik alaşımları de kabul edilir. Bu işlem sırasında mola veya viraj eğilimindedir 0.1mm daha ince ipuçları ile cımbız, tavsiye edilmez. </li><li> Süspansiyon orta (bkz. Bölüm 1) </li><li> Ham F12 orta veya Orta 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) Unsupplemented </li></ol> Prosedür: <ol><li> Aşağıdaki adımları steril kesme aletleri ve steril ortamda kullanarak, temiz, taslak ortamda yapılmalıdır. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskop kullanarak, 0.1 mm uçlu cımbız ile yapışan herhangi bir doku lenslerinizi temiz ve 5ml steril süspansiyon orta (bu adım kirliliği azaltmak için yardımcı olur) içeren ikinci bir 60mm kültür çanağı aktarabilirsiniz. Cımbız ile istenilen sayıda lens, 35mm kültür çanak 5ml steril, unsupplemented orta içeren bir transfer. (Daha düşük boya konsantrasyonu diseksiyon daha kolay hale getirir, çünkü Biz sık sık, bu adım için Ham F12 (Invitrogen) kullanmak; Ancak, Orta 199 de kabul edilebilir olan bu adımı sırasında yok antibiyotik ya da diğer ekleri ihtiyaç duyulmaktadır..) 12 eksplantlar yapılmış olması. Gibi gibi birçok Bu boyuttaki bir çanak merkezi. Ancak, daha az eksplantlar kesme aletleri küçük bir tabak içinde kolayca manipüle edilebilir, çünkü yapılması bile 35 mm çanak kullanılmalıdır. 37 az bir doku kültürü inkübatör kalan lensler içeren çanak Transfer ° C kadar ihtiyaç vardır. </li><li> Lensin arka tarafında belirleyin. Bunu tanımak için birçok yol vardır: 1) posterior, anterior, daha hafif basık yuvarlak, diseksiyon sırasında oda sıcaklığı gibi serin 2) Yenidoğan sıçan lensler soğuk katarakt formu. Soğuk katarakt lensi tamamen dolu değilse, arka tarafı opak bölgeden uzak tarafı. Opacity çanak 37 ısınma, objektif doldurdu ° C&#39;de birkaç dakika için tersine dönecektir. Arka tarafında soğutma üzerine katarakt reformlar olarak tespit edilebilir. 3) tunika vaskulosa lentis İzleri arka tarafında görülebilir. 4) posterior sütür arka tarafında görülebilir. Kapsül açılacak bu yana doğru arka tarafında belirlenmesi esastır. Ön tarafında Açılış lens epitel gözyaşı. </li><li> Arka tarafında tespit edildikten sonra, yukarı doğru açın ve sol cımbız lensi kavramak (sağ elini kullanan bir işçi için). Sonra küçük bir kıvrım üretmek doğru bir cımbız ile arka kapsül tutam. </li><li> Sağ cımbız ile arka kapsül tutarken, sol cımbız ile kapsül kat kavramak ve kapsül küçük bir gözyaşı yapmak zıt yönlerde iki çift cımbız çekin. </li><li> Cımbız ile geri çekilmeden kapsül kenarından kavrayarak, plastik cımbız ile çanak içine basarak, daha sonra diğer tarafta, bir tarafta ilk aşağı doğru çekin. Kapsül birçok noktada plaka sıkıca bağlı olduğu kadar, bütün lensin ekvator etrafında hareket, bu işlem birkaç kez tekrarlayın. Kapsül sol cımbız ile tutarak yavaşça sağ cımbız ile lens ekvatorda fiber hücreleri ve epitel hücreleri arasındaki eki kırmak için lif kütle kaya. Sonra alt takılı kalır kapsül / epiteli, haddeleme, uzak fiber kitle itinçanak. Çanak tüm lensler ile bu süreç devam etmektedir. Fiber kitleler (veya onlara lens proteinlerinin diğer çalışmalar için bir kaynak olarak dondurulmuş kaydetmek) çıkarın ve atın. </li></ol> Bölüm 3: Mikrodisseksiyon ve kültür merkezi eksplant Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Steril tek kullanımlık bisturi, # 15 bıçak, (Cincinnati Cerrahi Co Cincinnati, OH) </li><li> Kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile steril fosfat tamponlu salin </li><li> Kültür orta: Süspansiyon orta içeren 100ng/ml FGF-2 (Sigma Aldrich, Inc St Louis, MO). </li></ol> Prosedür: <ol><li> Steril bir neşter kullanılarak, sadece (CE) (Şekil merkezi epitel hücrelerinde oluşan merkezi bir meydanı yaklaşık 2.0mm, bir tarafta bırakarak, farklılaşma (Şekil 1A) erken aşamalarında hücreler içeren periferik epitel (PE), uzak trim 1B). </li><li> Bir biyogüvenlik kabine merkezi eksplantlar içeren çanak aktarın. Steril PBS ile bir kez 1ml taze, dengelenmiş (37 ° C,% 5 CO 2) süspansiyon orta kalsiyum ve magnezyum içeren ve 3 kere yıkayın. Bu bulaşma olasılığını büyük ölçüde azaltır yıkar. </li><li> Farklılaşma 1 neden ve 37 nemlendirilmiş, doku kültürü inkübatör eksplantlar kültür ortamı 2mL ekle ° C,% 5 CO 2. Kültür dönemleri birkaç saat gibi kısa ya da çalışılan parametreye bağlı olarak, 2-3 hafta gibi uzun uzatmak. Orta 2-3 günde bir değiştirilmesi gerekir. </li></ol> Bölüm 4: farklılaşma ile ilişkili olayların analizi için eksplantlar Hasat 1. Protein veya RNA analizi için Hasat eksplantlar Malzemeler: <ol><li> Microdissecting cımbız </li><li> SDS Lizis Tampon veya RNA daha sonra </li></ol> Prosedür: <ol><li> Kuluçka dönemi sonunda, kültür ortamı çıkarın. </li><li> Stereo diseksiyon mikroskobu kullanarak her eksplant kenarlarını hafifçe gevşetin. </li><li> Cımbız ile her eksplant kaldırın ve 100μl SDS lizis tamponu (protein analizi için) veya RNA daha sonra (RNA analizi için) ile ilgili içeren bir tüpe transfer. Eksplant cımbız sadık olmadığından emin olmak için çözüm cımbız ucu çalkalayın. </li></ol> 2. Immünofloresan için Hasat eksplantlar Malzemeler ve reaktifler: <ol><li> Fosfat, kalsiyum ve magnezyum (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile tamponlu salin </li><li> Fosfat (Invitrogen, Carlsbad, CA) tamponlu tuz (kalsiyum ve magnezyum olmadan) </li><li> % 4 paraformaldehid (Boston Bioproducts, Worcester, MA) </li><li> Microdissecting cımbız </li><li> Hidrofobik işaretleme kalemi </li><li> Cam mikroskop lamı </li><li> Fosfat% 0.25 &#39;lik Triton X-100 tamponlu salin. </li></ol> Prosedür: <ol><li> PBS, kalsiyum ve magnezyum içeren kısaca eksplantlar durulayın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid ekleyerek doku sabitleyin. </li><li> Fiksatif çıkarın ve fosfat tuzlu tamponlu ile değiştirin. Sabit eksplantlar onları immün kaldırdı ve cam slaytlar transfer sağlayan, biraz sert olur. </li><li> PBS, doku pozisyonu yardımcı ve kıvrık önlemek için slaytta küçük bir damla (kalsiyum ve magnezyum olmadan) yerleştirin. Microdissecting cımbız kullanarak, eksplant asansör ve slayt açılan takın. Eksplant dokunmadan dikkatlice camına eksplant düzleştirmek için bir kağıt fitil ile sıvı çıkarın ve oda sıcaklığında 3 ila 5 dakika süreyle havada doku kurumaya bırakın. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 A periferik epitel farklılaşması spesifik proteinlerin ifade eder. Mikrodiseksiyon hemen sonra N-kaderin gösterilen eksplant immunohistokimyasal oldu. İfade bu bölgedeki hücrelerin periferik epitel hücreleri çıkarmak için kesilmiş olabilir. B. ayırt başlamış olduğunu gösteren, bir grup çevre epitel hücreleri görülür ifade N-kaderin ve diğer farklılaşma spesifik proteinlerin. Kırmızı annulus hücrelerin yerini açık gri belirtilen küçük kare panel 1A gösterilen epitel kadranda temsil ederken N-kaderin, temsil eder. Periferik epitel ayırt etmek için henüz başlamamış tek hücreleri içeren merkezi bir kare bırakarak dört neşter kesimler tarafından kaldırılabilir.

<ol>
	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

Sıçan lens eksplant sistemi, laboratuvarlar, objektif lifleri 21,3,4,5 lens epitel hücrelerinin terminal farklılaşma çalışma bir dizi başarıyla kullanılır olmuştur. 100ng/ml FGF-2 maruz eksplantlar morfolojisi ve birkaç gün 3,4,5 içinde sırayla görünmesini gen ekspresyon değişiklikleri dakika 6 içinde sinyalizasyon değişiklikler göstermeye başlayacaktır. Bulaşmasını önlemek için bakım alınırsa kültürler 2-3 hafta için geçerli kalır. FGF-2 önce farklılaşma işaretleri ifade herhangi bir hücre 1,5 eklenir az içerdikleri için bu protokolü açıklanan merkezi eksplantlar, farklılaşma ile ilişkili olaylar dizisi çalışmak için özellikle yararlıdır. Bu hücreler daha sonra farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon ve transkripsiyonel olayların zaman seyrini takip etmek mümkün hale, bir kohort olarak, eş zamanlı olarak ayırt. Zaman farklı uzunluklarda kültür eksplantlar böylece sıra olaylar hakkında doğru Temporal bilgiler sağlar. Özel inhibitörleri ilgili sinyalizasyon yolları belirlemek için kültür ortamına ilave edilebilir. SDS jel elektroforezi ve immün eksplantlarındaki protein ekspresyonu analiz ya da RT-PCR ile spesifik mRNA&#39;ların ifade analiz etmek için kullanılıyor olabilir. - 20-50 mikrogram / eksplant ve RNA verim protein verimi aralığı yaklaşık 200 kültür döneminin uzunluğuna bağlı olarak 600 ng / eksplant. Biz genel olarak ortalama 5-6 eksplantlar çanak birkaç deneyleri için yeterli protein veya RNA sağlayacak bulabilirsiniz. Eksplantlar RNA gen ekspresyonu farklılaşması için kritik olabilecek yeni genlerin belirlenmesi mikroarray analizi, değerlendirilmesi için cDNA hazırlamak için kullanılabilir. Eksplantlarındaki da transfekte olabilir. Transfeksiyon verimliliği genellikle düşük olsa da, o muhabir genler assaying 4 için yeterli; 7, 8. Eksplantlar immünofloresan mikroskopi ilgi proteinlerin hücre içi yerinin belirlenmesi için yararlı bir ek biyokimyasal yöntemler sağlar. Böylece, sıçan lens eksplant hazırlanması ve kültür, in vivo teknikleri, transgenik ve knock-out farelerde üretimi gibi tamamlayıcı memeliler terminal objektif farklılaşma çalışmak için güçlü bir sistem sağlar.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

Oküler lensin ön yüzeyinde siliyer cisim altta yatan bir anüler bölgesi prolifere epitel hücreleri, bir tek tabaka ile kaplıdır. Retina difüzyon FGF, onları uzatılmış objektif lens toplu oluşturan lif hücreleri, posterior diziye ayırt etmek için indükler bölümü takiben, bu hücrelerin, posteriora göç. FGF-2 varlığı ön epitel merkezi bölgenin kültür eksplantlar lens liflerinin içine lens epitel hücreleri farklılaşma in vitro olarak uyarılabilir. Eksplantlarındaki neonatal sıçanlarda lensler, gözün lensi çıkarmadan ve lens kapsülünün diseksiyon cımbız ile arka tarafındaki kavrama hazırlanmıştır. Daha sonra arka kapsül hafifçe açık parçalanmış ve plastik bir doku kültürü çanak dibine basılı. Eksplant periferik bölgelerinde bir neşter ile silinir ve daha sonra merkezi bir bölgede, incelenmesi gereken parametreler bağlı olarak 2-3 hafta gibi uzun bir FGF-2 100ng/ml varlığında kültüre. Hafta günlük bir süre içinde yaklaşık senkronize kültürlü eksplantlar epitel hücreleri ayırt bu yana, sinyalizasyon ve gen ekspresyonu zaman ders, moleküler, biyokimyasal ve farmakolojik teknikler kullanılarak tespit edilebilir. İmmünofloresan mikroskopi, bu yöntemlerin güçlü bir yardımcı ilgi proteinlerin hücre içi lokalizasyonu gösterir ve sinyal yolları deneysel manipülasyon fizyolojik sonuçlar ortaya çıkarabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation at JoVE.com

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

FGF-2 varlığı kültüre sıçan lens epitel merkez bölgesi eksplantlarındaki eşzamanlı ayırt. Gibi kültürlerin İmmünofloresan mikroskopi gen ekspresyonu ve terminal farklılaşma ile ilgili sinyalizasyon olaylar hakkında yeni bilgiler sağlar.

Terminal Farklılaşma incelenmesi için hazırlanması ve Rat Lens Epitel eksplantlar Kültür

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

Research

JoVE Journal

Biology

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Eksplantlar gelen Yetiştirilen İlköğretim İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Biyomekanik ve Mechanobiological Araştırmalar Rat Kuyruk Tendonlar hazırlanması

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Newt Lens Rejenerasyon Eğitim Kültürleme İris Pigment Epitel Hücreler için Sistem

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

İnsan bağırsak mukozasının eksplantlar Kültür ve Polarize Uyarım için Yeni Bir Yöntem

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Memeli Tüm Embriyo Kültürü için uygun Rat Serum hazırlanması

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...