Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

نشكر الدكتور T. أوتيس ، قسم علم الأعصاب ، جامعة كاليفورنيا ، لتقاسم مرفق TPLSM معنا ، الدكتور جيم Fahlke ، معهد الفيزيولوجيا ، آخن ، ألمانيا ، على سبيل الهبة الكريمة من البلازميد pEYFP - ClC1 ، والسيد . ر سيرانو للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة / NIAMS المنح وAR047664 AR54816.

إجراءات تجريبية في عضلات الجسم الحي electroporation FDB وIO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في بروتوكولات electroporation الجسم الحي ، لا بد من تضخيم البلازميدات التعبير الثدييات لانتاج التركيز في نطاق ل2-5 ميكروغرام ملاحظة البلازم...

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

نحن هنا وصف الخطوات التفصيلية التي يجب اتباعها من أجل تحقيق فعالية transfections البلازميدات الحمض النووي في ألياف العضلات والهيكل العظمي التي electroporation في الجسم الحي. المزايا الرئيسية لنهجنا هي البساطة في التنفيذ ، والغزو ويعتبر الحد الأدنى الذي ينتج مخاطر صحية ضئيل?...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

والاهتمام المتزايد في بيولوجيا الخلية وأشكال التعبير عن تعديل transgenically من البروتينات الضرورية (على سبيل المثال يبني الموسومة fluorescently و / أو المتغيرات متحولة) من أجل التحقيق في توزيعها وأهميتها الذاتية الوظيفية. مقاربة مثيرة للاهتمام التي تم تنفيذها لتحقيق هذا الهدف في خلايا متمايزة تماما هو<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ترنسفكأيشن من البلازميدات بواسطة أساليب مختلفة في أنسجة معينة مثل الكبد<sup&gt; 1</sup&gt; ، الهيكل العظمي والعضلات<sup&gt; 2،3</sup&gt; ، وحتى في الدماغ<sup&gt; 4</sup&gt;. نقدم هنا وصفا مفصلا للخطوات التي يجب اتباعها من أجل transfect بكفاءة في المادة الوراثية للألياف<em&gt; المثنية القصيرة للأصابع</em&gt; (FDB) و<em&gt; بين العظمية</em&gt; (IO) عضلات الفئران البالغة باستخدام<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; نهج electroporation. وقد تم تحسين المعلمات التجريبية وذلك لزيادة عدد الألياف العضلية مع تقليل الأضرار transfected الأنسجة التي قد تنال من نوعية وكمية البروتينات التي أعرب عنها في الألياف الفردية. لقد تحققنا من أن تنفيذ المنهجية الواردة في هذه الورقة في نتائج عالية الغلة من البروتينات القابلة للذوبان ، أي EGFP وECFP<sup&gt; 3</sup&gt; ، calpain ، FKBP12 ، β2a - DHPR ، الخ ؛ البروتينات الهيكلية ، أي minidystrophin وα actinin ؛ وبروتينات الغشاء ، أي α1s - DHPR ، RyR1 ، القلب نا / CA<sup&gt; 2 +</sup&gt; مبادل ، NaV1.4 نا القناة ، SERCA1 ، وما إلى ذلك ، عندما يطبق على FDB ، IO والعضلات الأخرى من الفئران والجرذان. وقد تم التحقق من كفاءة التعبير عن بعض هذه البروتينات مع البيوكيميائية<sup&gt; 3</sup&gt; والأدلة الفنية<sup&gt; 5</sup&gt;. ومع ذلك ، إلى حد بعيد النهج الأكثر شيوعا التي يستخدمها التأكيدي منا المجهر الفلورسنت القياسية و2 - الفوتون المجهري مسح بالليزر (TPLSM) ، التي تسمح لتحديد ليس فقط التعبير عموما ، ولكن أيضا توطين مفصلة بين الخلايا ، ليبني البروتين الموسومة fluorescently. يمكن أن تكون الطريقة المستخدمة بالتساوي على transfect البلازميدات ترميز للتعبير عن بروتينات ذات الصلة الفسيولوجية (كما هو موضح هنا) ، أو للتدخل الحمض النووي الريبي (سيرنا) تهدف الى قمع التعبير عن البروتينات وأعرب عادة (وليس لنا بعد اختباره من قبل). وتجدر الإشارة إلى أن ترنسفكأيشن من ألياف العضلات وFDB IO ذات أهمية خاصة للتحقيق في فسيولوجيا الثدييات منذ ألياف العضلات إنزيمي فصلها من هذه العضلات هي حاليا واحدة من أكثر النماذج المناسبة للتحقيق في الآليات الأساسية لتوصيل الإثارة واستثارة الانكماش تحت الظروف الراهنة أو المشبك الجهد<sup&gt; 2،6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

نحن تصف إجراءات تفصيلية لترنسفكأيشن فعالة من الحمض النووي البلازميد في ألياف عضلات القدم من الفئران الحية باستخدام electroporation والتصور لاحقة من بروتين تعبير باستخدام المجهر مضان.

ترنسفكأيشن الحمض النووي لعضلات الهيكل العظمي باستخدام الثدييات في فيفو Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

في الجسم الحي من Electroporation Morpholinos في شبكية العين اسماك الزرد الكبار

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

متساوي القياس وغريب الأطوار التقييم تكوين القوات من عضلات الهيكل العظمي المعزولة من الفئران نماذج من ضمور العضلات

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...