Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

Nous remercions le Dr T. Otis, département de neurobiologie, UCLA, pour le partage de l&#39;installation TPLSM avec nous, le Dr C. Fahlke, Institut de Physiologie, RWTH Aachen, en Allemagne, pour le don en nature du plasmide pEYFP-ClC1, et M. . R. Serrano pour le soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH / NIAMS subventions et AR047664 AR54816.

Procédures expérimentales pour l&#39;électroporation in vivo de muscles FDB et IO <ol><li> Avant de commencer l&#39;électroporation in vivo dans des protocoles, des plasmides d&#39;expression mammifère doit être amplifié pour produire de concentration dans la gamme de à 2-5 mg Remarque plasmidique / ul de TE:. Nous utilisons régulièrement des kits d&#39;amplification commerciaux et suivre les procédures du fabricant. Plasmides d&#39;expression commerciaux transportant le trava...

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	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

Nous décrivons ici les étapes détaillées qui doivent être suivies afin d&#39;atteindre transfections efficace de plasmides ADN dans les fibres musculaires squelettiques par électroporation in vivo. Les principaux avantages de notre approche sont la simplicité de mise en œuvre et son caractère invasif minimal qui en résulte risque négligeable pour la santé des animaux. En réalité, les protocoles ci-dessus décrite électroporation n&#39;entraînent pas beaucoup plus que les injections sous-cutanée...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Un intérêt croissant pour la biologie cellulaire est d&#39;exprimer des formes modifiées transgénique de protéines essentielles (par exemple les constructions fluorescence marqués et / ou de variants mutants) afin d&#39;étudier leur distribution endogène et de la pertinence fonctionnelle. Une approche intéressante qui a été mis en œuvre pour atteindre cet objectif dans les cellules complètement différenciées est le<em&gt; In vivo</emTransfection&gt; de plasmides par diverses méthodes dans des tissus spécifiques tels que le foie<sup&gt; 1</sup&gt;, Le muscle squelettique<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Et même le cerveau<sup&gt; 4</sup&gt;. Nous présentons ici une description détaillée des étapes qui doivent être suivies afin d&#39;transfecter efficacement matériel génétique dans les fibres du<em&gt; Court fléchisseur des orteils</em&gt; (FDB) et<em&gt; Interosseux</em&gt; (OI) des muscles de souris adultes en utilisant une<em&gt; In vivo</emApproche de l&#39;électroporation&gt;. Les paramètres expérimentaux ont été optimisés de manière à maximiser le nombre de fibres musculaires transfectées tout en minimisant les dommages tissulaires qui peuvent nuire à la qualité et la quantité des protéines exprimées dans les fibres individuelles. Nous avons vérifié que la mise en œuvre de la méthodologie décrite dans cet article les résultats d&#39;un haut rendement de protéines solubles, soit EGFP et ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, La calpaïne, FKBP12, β2a-DHPR, etc; protéines structurales, c&#39;est à dire minidystrophine et α-actinine et les protéines membranaires, soit α1s-DHPR, RyR1, cardiaques Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Échangeur, NaV1.4 canaux Na, SERCA1, etc, lorsqu&#39;il est appliqué à FDB, IO et autres muscles de souris et de rats. L&#39;expression efficace de certaines de ces protéines a été vérifiée avec biochimiques<sup&gt; 3</sup&gt; Et fonctionnelles des preuves<sup&gt; 5</sup&gt;. Cependant, de loin l&#39;approche la plus commune de confirmation que nous utilisons sont la norme microscopie à fluorescence et la microscopie laser 2-photons balayage (TPLSM), qui permettent d&#39;identifier non seulement l&#39;expression d&#39;ensemble, mais aussi la localisation intracellulaire détaillées, des constructions de protéines par fluorescence marqués. La méthode pourrait être également utilisé pour transfecter des plasmides codant pour l&#39;expression des protéines de pertinence physiologique (comme ici), ou pour l&#39;interférence ARN (siRNA) visant à supprimer l&#39;expression des protéines normalement exprimés (non testé par nous encore). Il faut noter que la transfection de fibres musculaires FDB et IO est particulièrement pertinent pour l&#39;enquête de la physiologie musculaire chez les mammifères car les fibres enzymatiquement dissocié de ces muscles sont actuellement l&#39;un des modèles les plus appropriés pour étudier les mécanismes de base de couplage de l&#39;excitabilité et excitation-contraction dans conditions pince de courant ou tension<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Nous décrivons des procédures détaillées pour la transfection efficace de l&#39;ADN plasmidique dans les fibres des muscles du pied des souris vivantes en utilisant l&#39;électroporation et la visualisation ultérieure de l&#39;expression des protéines en utilisant la microscopie à fluorescence.

Transfection d&#39;ADN des mammifères muscles squelettiques à l&#39;aide In Vivo L&#39;électroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection d&#39;ADN dans intranucléaires Dissocié neurones de mammifères adultes

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Recherche

Biologie

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

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L&#39;analyse de l&#39;ADN double-brin Break (ORD) de réparation dans les cellules de mammifères

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

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En électroporation in vivo de morpholinos dans la rétine de poisson zèbre adulte

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

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Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Isométrique et excentrique évaluation de génération de forces des muscles squelettiques Isolé à partir des modèles murins de dystrophies musculaires

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imagerie en temps réel de l&#39;unité d&#39;ingénierie des ARN transcrits dans des cellules vivantes utilisant Ratiométrique bimoléculaires Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

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In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

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Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Examen des protéines liées à Nascent ADN dans les cellules de mammifères utilisant la technique BrdU-Chip-Slot-Ouest

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...