Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
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Wir danken Dr. T. Otis, Department für Neurobiologie, UCLA, für die gemeinsame Nutzung der TPLSM Anlage mit uns, Dr. C. Fahlke, Institut für Physiologie, RWTH Aachen, Deutschland, für die freundliche Spende der pEYFP-ClC1 Plasmid, und Herr . R. Serrano für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von NIH / NIAMS gewährt AR047664 und AR54816 unterstützt.

Experimentelle Verfahren zur in-vivo-Elektroporation von FDB und IO Muskeln <ol><li> Vor Beginn der in vivo Elektroporation Protokolle müssen Säugetieren Expressionsplasmide verstärkt um die Konzentration im Bereich von auf 2-5 pg Plasmid / ul TE Hinweis ergeben werden:. Wir verwenden routinemäßig kommerzielle Verstärkung Kits und folgen Sie den Hersteller &quot;Verfahren. Gewerbliche Expressionsplasmide Durchführung der CMV-Promotor arbeiten sehr gut im Skelettmuskel in vivo Tran...

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	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte, die folgten, um eine effektive Transfektion von DNA-Plasmiden in Skelettmuskelfasern erreichen durch in vivo Elektroporation werden sollte. Die wesentlichen Vorteile unseres Ansatzes sind die Einfachheit der Implementierung und ihrer minimalen Invasivität, die in vernachlässigbarer Gefahr für die Gesundheit der Tiere führt. In Wirklichkeit haben die oben beschriebene Elektroporation Protokolle nicht erfordert weit mehr als zwei subkutane Injektionen pro Fuß, dur...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Ein wachsendes Interesse in der Zellbiologie ist transgen zu veränderten Formen der essentiellen Proteine ​​(zB fluoreszenzmarkierten Konstrukte und / oder mutierte Varianten) auszudrücken, um ihre endogene Verteilung und funktionelle Bedeutung zu untersuchen. Ein interessanter Ansatz, der umgesetzt wurde, um dieses Ziel in ausdifferenzierten Zellen erfüllen, ist der<em&gt; In vivo</em&gt; Transfektion von Plasmiden durch verschiedene Methoden in bestimmten Geweben wie Leber<sup&gt; 1</sup&gt;, Skelettmuskel<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Und sogar das Gehirn<sup&gt; 4</sup&gt;. Wir stellen Ihnen hier eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die befolgt werden, um effizient transfizieren genetischen Materials in die Fasern der muss<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) und<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) Muskeln des erwachsenen Mäusen mit einem<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation Ansatz. Die experimentellen Parameter wurden so die Anzahl der Muskelfasern transfizierten gleichzeitiger Minimierung Gewebeschäden, dass die Qualität und Quantität der Proteine ​​in einzelnen Fasern ausgedrückt beeinträchtigen maximieren optimiert. Wir haben überprüft, dass die Umsetzung der Methodik in diesem Papier beschrieben in einer hohen Ausbeute an löslichen Proteinen, dh EGFP und ECFP Ergebnisse<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, etc.; Strukturproteine, dh minidystrophin und α-Actinin und Membranproteine, dh α1s-DHPR, RyR1, kardiale Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Wärmetauscher, NaV1.4 Na-Kanal, SERCA1, etc., wenn sie auf FDB, IO und andere Muskeln von Mäusen und Ratten angewendet. Die effiziente Expression einiger dieser Proteine ​​mit biochemischen überprüft<sup&gt; 3</sup&gt; Und funktionellen Nachweis<sup&gt; 5</sup&gt;. Allerdings sind bei weitem die häufigste bestätigenden Ansatz von uns verwendeten Standard-Fluoreszenz-Mikroskopie und 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM), die nicht nur die allgemeine Ausdruck zu identifizieren lassen, sondern auch die detaillierte intrazelluläre Lokalisation von fluoreszenzmarkierten Protein-Konstrukten. Die Methode könnte auch genutzt werden, um Plasmide, die für die Expression von Proteinen der physiologischen Relevanz (wie hier) zu transfizieren, oder für RNA-Interferenz (siRNA) mit dem Ziel, die Expression von normalerweise exprimierten Proteine ​​(nicht von uns getestet) zu unterdrücken. Anzumerken ist, dass die Transfektion von FDB und IO Muskelfasern besonders relevant ist für die Untersuchung von Säugetieren Muskelphysiologie seit Fasern enzymatisch losgelöst von diesen Muskeln derzeit einer der am besten geeigneten Modelle zur grundlegenden Mechanismen der Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unter untersuchen Strom oder Spannung Klemme Bedingungen<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Wir beschreiben detaillierte Verfahren für die effiziente Transfektion von Plasmid-DNA in die Fasern der Fußmuskulatur von lebenden Mäusen mittels Elektroporation und der nachfolgenden Darstellung der Proteinexpression mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie.

DNA Transfektion von Säuger Skelettmuskulatur mit In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranukleäre Mikroinjektion von DNA in Dissoziierte Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Forschung

Biologie

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In-vivo-Elektroporation von Morpholinos in die Adult Zebrafisch Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Isometrische und exzentrische Krafterzeugung Beurteilung der Skelettmuskulatur Isoliert von Mausmodellen von Muskeldystrophien

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, Isolierung und Imaging von Muskelfasern

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Untersuchung von Proteinen, entstehende DNA in Säugerzellen Bound Mit BrdU-chip-Slot-westliche Technik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...