Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר ט אוטיס, המחלקה לנוירוביולוגיה, UCLA, לשיתוף מתקן TPLSM איתנו, ד&quot;ר ג Fahlke, המכון לפיזיולוגיה, RWTH אאכן, גרמניה, על התרומה סוג של pEYFP-ClC1 פלסמיד, ומר . ר סראנו לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH / NIAMS מענקים AR047664 ו AR54816.

הפרוצדורות שכן electroporation vivo של השרירים FDB ו IO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת בפרוטוקולים vivo electroporation, פלסמידים ביטוי יונקים יש ריכוז מוגבר להניב בטווח של עד 2-5 מיקרוגרם הערה פלסמיד / μl של TE:. אנו משתמשים באופן שגרתי ערכ?...

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

אנו מתארים כאן את הצעדים מפורט כי יש לפעול כדי להשיג transfections יעיל של פלסמידים DNA לתוך סיבי שריר השלד על ידי electroporation ב vivo. היתרונות העיקריים של הגישה שלנו הן את הפשטות של היישום, הפולשנות שלו מינימלית שתוצאתה סיכון בריאותי זניח לבעלי החיים. במציאות, פרוטוקולים מעל ...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

עניין גובר בביולוגיה של התא היא להביע צורות transgenically שונה של חלבונים חיוניים (למשל בונה מתויג fluorescently ו / או וריאנטים מוטנטיים) על מנת לחקור הפצה אנדוגניים שלהם ואת הרלוונטיות תפקודית. גישה מעניינת כי יושם להגשים מטרה זו בתאים הבדיל באופן מלא הוא<em&gt; In vivo</em&gt; Transfection של פלסמידים על ידי שיטות שונות לתוך רקמות ספציפיות כגון הכבד<sup&gt; 1</sup&gt;, שרירי השלד<sup&gt; 2,3</sup&gt;, וגם את המוח<sup&gt; 4</sup&gt;. אנו מציגים כאן תיאור מפורט של הצעדים שיש אחריו על מנת ביעילות transfect החומר הגנטי לתוך סיבי של<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) ו<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) בשרירים של עכברים מבוגרים באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; גישה electroporation. הפרמטרים ניסיוני מוטבו כדי למקסם את מספר סיבי השריר transfected תוך מזעור הנזק לרקמות שעשוי לפגום באיכות וכמות החלבונים המתבטאת סיבים בודדים. יש לנו אומת כי יישום המתודולוגיה המתוארת במאמר זה תוצאות תשואה גבוהה של חלבונים מסיסים, כלומר EGFP ו ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, וכו &#39;; חלבונים מבניים, כלומר minidystrophin ו α-actinin וכן חלבונים בממברנה, כלומר α1s-DHPR, RyR1, לב Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; מחליף, NaV1.4 Na הערוץ, SERCA1 וכו &#39;, כשהם מיושמים FDB, IO ושרירים אחרים של עכברים וחולדות. הביטוי יעיל של כמה חלבונים אלה אומת עם ביוכימיים<sup&gt; 3</sup&gt; ופונקציונלי ראיות<sup&gt; 5</sup&gt;. עם זאת, ספק גישה מאשרות הנפוצים ביותר בשימוש על ידי מאיתנו מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל 2-פוטון מיקרוסקופית סריקת לייזר (TPLSM), המאפשרים לזהות לא רק את הביטוי הכללי, אלא גם לוקליזציה תאיים מפורט, של החלבון בונה מתויג fluorescently. השיטה יכולה לשמש באותה מידה transfect פלסמידים קידוד לביטוי של חלבונים הרלוונטיות פיזיולוגיים (כפי שמוצג כאן), או התערבות RNA (siRNA) במטרה לדכא את הביטוי של חלבונים הביעו בדרך כלל (לא נבדק על ידינו עדיין). יצוין כי transfection של סיבי שריר FDB ו IO רלוונטי במיוחד עבור חקירת הפיזיולוגיה שריר יונקים מאז סיבי enzymatically ניתק מן השרירים הללו כיום אחד הדגמים הכי מתאים לחקור את המנגנונים הבסיסיים של צימוד עירור רגישות ו-התכווצות תחת מהדק התנאים הנוכחיים או מתח<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

הערכת דור חיל איזומטרי והאקסצנטרית של שרירי שלד מבודד ממודלים עכבריים של ניוון שרירים

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...