Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

私達は私達とTPLSM施設を共有するために博士T.オーティス、神経生物学、UCLAの部、感謝、博士C. pEYFP - ClC1プラスミドの種類の寄付のためのFahlke、生理学研究所、アーヘン工科大学、ドイツ、、と氏技術サポートのため。R.セラーノ。この作品は、NIH / NIAMS助成AR047664とAR54816からの補助金によって支えられている。

FDBとIO筋肉の in vivoエレクトロポレーションのための実験手順<ol><li> 生体内エレクトロポレーションプロトコルで開始する前に、哺乳動物発現プラスミドはTEの添加/プラスミド2から5μgまでの範囲で濃度を得るために増幅する必要があります注：我々は日常的に商業的な増幅キットを使用すると、メーカーの手順に従う。 in vivoでトランスフェクションの骨格筋?...

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	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

ここでは、in vivoでのエレクトロポレーションのことで骨格筋線維へのDNAプラスミドの効果的なトランスフェクションを達成するために従わなければならない詳細な手順を説明します。我々のアプローチの主な利点は、動物にごくわずかの健康被害をもたらすの実装のシンプルさ、そしてその最小限の侵襲です。現実には、上述のエレクトロポレーションプロトコルは、麻酔下の...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

細胞生物学への関心の高まりは、内因性の分布と機能的関連性を調べるために必須のタンパク質（例えば、蛍光標識の構造及び/または突然変異体）の遺伝子導入によって修飾された形態を発現させることである。完全に分化した細胞ではこの目的を達成するために実装されている面白いアプローチです<em&gt; in vivoで</em肝臓などの特定の組織への様々な方法により、プラスミドの&gt;トランスフェクション<sup&gt; 1</sup&gt;、骨格筋<sup&gt; 2,3</sup&gt;、とさえ脳<sup&gt; 4</sup&gt;。ここでは、効率の繊維に遺伝物質をトランスフェクトするために従わなければならない手順の詳細な説明を提示する<em&gt;短趾屈筋</em&gt;（FDB）と<em&gt;骨間</em使用して成体マウスの&gt;（IO）の筋肉<em&gt; in vivoで</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ。実験パラメータは、個々の繊維で発現されるタンパク質の質と量を損なうおそれがある組織の損傷を最小限に抑えながら、トランスフェクトされた筋線維の数を最大化するように最適化されています。我々は、このホワイトペーパーで説明されている方法論の実装では、可溶性タンパク質の高収率、すなわち、EGFPおよびECFPをもたらすことが確認されました。<sup&gt; 3</sup&gt;、カルパイン、FKBP12、β2a- DHPR、等、構造タンパク質、すなわちminidystrophinとα-アクチニン、および膜タンパク質、すなわちα1s- DHPR、RyR1、心臓のNa / Ca比<sup&gt; 2 +</supFDB、IOとマウスやラットの他の筋肉に適用される&gt;交換器、NaV1.4ナトリウムチャネル、SERCA1、等、。これらのタンパク質のいくつかの効率的な発現は、生化学的に検証されています<sup&gt; 3</sup&gt;と機能的な証拠<sup&gt; 5</sup&gt;。しかし、はるかに私達が使用する最も一般的な確証的なアプローチは、蛍光標識蛋白質の構造の標準的な蛍光顕微鏡と2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、全体の式ではないだけを識別できるだけでなく、詳細な細胞内局在はです。方法は、均等に（ここに示すように）生理的関連性のタンパク質の発現をコードするプラスミドをトランスフェクトするために使用、または干渉RNA（siRNA）のため、通常は発現されるタンパク質（まだ私たちでテストされていない）の発現を抑制することを目指してすることができます。それはこれらの筋肉から酵素的に解離繊維が下の興奮性と興奮収縮カップリングの基本的なメカニズムを調べるために現在最も適切なモデルの一つであるため、FDBとIO筋線維のトランスフェクションは、哺乳類の筋肉の生理学の研究に特に関連であることに注意する必要があります電流または電圧クランプ状態<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;。

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

我々は、エレクトロポレーションと蛍光顕微鏡を用いたタンパク質発現のその後の可視化を使用して、生きたマウスの足の筋肉の繊維へのプラスミドDNAの効率的なトランスフェクションのための詳細な手順を説明します。

使用して哺乳類の骨格筋のDNAトランスフェクションインビボでのエレクトロポレーション

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

解離成体哺乳類の神経細胞へのDNAの核内マイクロインジェクション

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

筋ジストロフィーのマウスモデルから分離された骨格筋の等尺性と偏心力発生アセスメント

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

マウス骨格筋におけるDNA損傷の検出と分析<em&gt;その場で</em&gt; TUNEL法を用いた

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNAエレクトロポレーション、筋線維の単離およびイメージング

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...