Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

우리는 우리와 함께 TPLSM 시설을 공유 박사 T. 오티스, 신경 생물학, UCLA의 부, 감사, 박사 C. pEYFP - ClC1 플라스미드의 종류 기증 Fahlke, 생리학 연구소, RWTH 아헨, 독일, 그리고 미스터 기술 지원. R. 세라노. 이 작품은 NIH / NIAMS 부여 AR047664과 AR54816의 보조금에 의해 지원되었다.

FDB 및 IO 근육의 생체내 electroporation에 대한 실험 절차 <ol><li> . 생체내의 electroporation 프로토콜의를 시작하기 전에, 포유류의 표현 plasmids는 2-5 μg TE의 μl / 플라스미드 참고 범위의 농도를 얻을 수로 증폭해야합니다 우리는 정기적으로 상업 증폭 키트를 사용하여 제조 업체 &#39;절차를 따르십시오. 생체내 transfections의 골격근에서 매우 잘 CMV 프로 모터의 작동 실은 상...

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	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

우리는 여기서 생체내의 electroporation에 의해 골격 근육 섬유로의 DNA plasmids 효과 transfections을 달성하기 위해 따라야 할 자세한 단계를 설명합니다. 우리의 접근 방법의 주요 장점은 구현의 단순하고, 동물 무시할 건강 위험의 결과는 최소한의 invasiveness 있습니다. 현실에서는, 위에서 설명한 electroporation 프로토콜은 마취에서 동물에 의해 잘 용납하는 모든 중 전기 자극 프로토콜에 의해 뒤에...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

세포 생물학에 관심이 점점 자신의 내생적인 분포와 기능 관련을 조사하기 위해 필수적인 단백질 (예 : 찬란 태그를 구성 및 / 또는 돌연변이 변종)의 transgenically 수정된 형태를 표현하는 것입니다. 완전히 차별화된 세포에서이 목표를 성취하기 위해 구현되었습니다 흥미로운 접근 방식입니다<em&gt; 생체내에</em같은 간장과 같은 특정 조직에 다양한 방법으로 plasmids의&gt; transfection<sup&gt; 1</sup&gt;, 골격​​근<sup&gt; 2,3</sup&gt;, 그리고 심지어 두뇌<sup&gt; 4</sup&gt;. 우리는 여기서 효율적으로의 섬유로 유전 물질을 transfect하기 위해 따라야합니다 단계에 대한 자세한 설명을 제시<em&gt; flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB)와<em&gt; interosseus</em를 사용하여 성인 마우스&gt; (IO) 근육<em&gt; 생체내에</em&gt; electroporation 접근. 실험 매개 변수는 각각의 섬유로 표현 단백질의 품질과 수량을 손상 수 있습니다 조직 손상을 최소화하면서 transfected 근육 섬유의 수를 최대화하기 위해처럼 최적화되었습니다. 우리는이 문서에서 설명하는 방법의 구현 수용성 단백질의 높은 수율, 즉 EGFP와 ECFP 결과 확인했습니다<sup&gt; 3</sup&gt; calpain, FKBP12, β2a - DHPR 등, 구조 단백질, 즉 minidystrophin과 α - actinin 및 막 단백질, 즉 α1s - DHPR, RyR1, 심장 나 / CA<sup&gt; 2 +</supFDB, IO와 생쥐와 쥐의 다른 근육에 적용&gt; 교환기, NaV1.4 나 채널, SERCA1 등. 이러한 단백질 중 일부의 효율적인 표현은 생화학과 함께 확인되었습니다<sup&gt; 3</sup&gt; 및 기능 증거<sup&gt; 5</sup&gt;. 그러나, 훨씬 우리가 사용하는 가장 일반적인 확실한 방법은 찬란 태그 단백질 구조의 표준 형광 현미경 및 2 광자 레이저 스캔 현미경 (TPLSM), 전반적인 표현뿐만 아니라 식별하도록 허용뿐만 아니라 세부적인 세포 로컬 리 제이션은 다음과 같습니다. 방법은 동일합니다 (여기에 표시) 생리 관련의 단백질의 표현을위한 인코딩 plasmids를 transfect하는 데 사용하거나, 간섭 RNA (siRNA)를 일반적으로 표현 단백질 (아직 저희가 테스트하지)의 표현을 억제하는 목표 수 있습니다. 그것은이 근육의 효소 dissociated 섬유 아래는 흥분하고 여기 - 수축 결합의 기본 메커니즘을 조사하기 위해 현재 가장 적합한 모델 중 하나이기 때문에 FDB 및 IO 근육 섬유의 transfection은 포유류의 근육 생리학의 조사에 특히 관련이 있다고 지적한다 전류 또는 전압 클램프 조건<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

연구

생물학

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

포유 동물 세포의 DNA 이중 가닥 브레이크 (DSB) 수리 분석

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

골격 근육의 Isometric 나기도하고 강제로 생성 평가는 절연 근육질 Dystrophies의 손쥐 모델에서

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

마우스 골격근에있는 검색, 탐지 DNA 손상 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; TUNEL 방법을 사용하여

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...