Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
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Agradecemos al Dr. T. Otis, del Departamento de Neurobiología de la UCLA, para compartir las instalaciones TPLSM con nosotros, el Dr. C. Fahlke, Instituto de Fisiología de la RWTH Aachen, Alemania, por la generosa donación del plásmido pEYFP-CLc1, y el Sr. . R. Serrano para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH / NIAMS AR047664 subvenciones y AR54816.

Procedimientos experimentales en el electroporación in vivo de los músculos y FDB IO <ol><li> Antes de iniciar el protocolo de electroporación in vivo, los plásmidos de expresión de mamíferos debe ser amplificada para producir la concentración en el rango de 2.5 mg de plásmido Nota / l de TE:. Habitualmente usamos kits comerciales de amplificación y seguir los procedimientos del fabricante. Plásmidos comerciales expresión que lleva el trabajo de promotor CMV ...

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	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

Se describe aquí los pasos detallados que deben seguirse para alcanzar la transfección eficaz de los plásmidos de ADN en las fibras del músculo esquelético en la electroporación in vivo. Las principales ventajas de nuestro enfoque es la simplicidad de implementación, y su mínima invasividad que se traduce en riesgo insignificante para la salud de los animales. En realidad, el anteriormente descrito protocolos de electroporación no implican mucho más que dos inyecciones subcutáneas por pie, s...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Un creciente interés en la biología de las células es la de expresar las formas transgénicamente modificada de proteínas esenciales (por ejemplo, construye marcados con fluorescencia y / o variantes mutantes) con el fin de investigar su distribución endógena y la relevancia funcional. Un enfoque interesante que se ha implementado para cumplir con este objetivo en las células completamente diferenciadas es la<em&gt; In vivo</em&gt; Transfección de plásmidos por diversos métodos en tejidos específicos, tales como el hígado<sup&gt; 1</sup&gt;, El músculo esquelético<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Y hasta el cerebro<sup&gt; 4</sup&gt;. Presentamos aquí una descripción detallada de los pasos que deben seguirse a fin de transfectar eficientemente material genético en las fibras de la<em&gt; Flexor corto de los dedos</em&gt; (FDB) y<em&gt; Interóseo</em&gt; (IO), los músculos de ratones adultos con un<em&gt; In vivo</emEnfoque&gt; electroporación. Los parámetros experimentales se han optimizado para maximizar el número de fibras musculares transfectadas y reducir al mínimo los daños al tejido que puede poner en peligro la calidad y cantidad de las proteínas expresadas en fibras individuales. Hemos comprobado que la aplicación de la metodología descrita en este artículo da lugar a un alto rendimiento de proteínas solubles, es decir, EGFP y ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpaína, FKBP12, β2a-DHPR, etc, proteínas estructurales, es decir, minidistrofina y α-actinina, y proteínas de la membrana, es decir, α1s-DHPR, RyR1, cardiaca Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Intercambiador, NaV1.4 canal de Na, SERCA1, etc, cuando se aplica a la FDB, IO y otros músculos de los ratones y las ratas. La expresión eficaz de algunas de estas proteínas ha sido verificada con bioquímicos<sup&gt; 3</sup&gt; Y funcionales pruebas<sup&gt; 5</sup&gt;. Sin embargo, con mucho, el método de confirmación más comunes utilizados por nosotros son la microscopía fluorescente estándar y 2-fotón microscopía de escaneo láser (TPLSM), que permiten identificar no sólo la expresión global, sino también la localización intracelular detallada, de las construcciones de proteína marcado con fluorescencia. El método podría ser igualmente utilizado para transfectar plásmidos que codifican para la expresión de proteínas de relevancia fisiológica (como se muestra aquí), o de ARN de interferencia (siRNA) con el objetivo de suprimir la expresión de proteínas normalmente se expresa (no probado por nosotros con todo). Cabe señalar que la transfección de las fibras musculares y FDB IO es particularmente relevante para la investigación de la fisiología del músculo de mamíferos ya que las fibras disociadas enzimáticamente a partir de estos músculos son actualmente uno de los modelos más adecuados para investigar los mecanismos básicos de la excitabilidad y acoplamiento excitación-contracción en corriente o voltaje condiciones pinza<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

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DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Se describen los procedimientos detallados para la transfección eficiente de ADN plásmido en las fibras de los músculos del pie de ratones vivos utilizando electroporación y la visualización posterior de la expresión de proteínas mediante microscopía de fluorescencia.

La transfección de ADN de músculos esqueléticos de mamíferos con En Vivo La electroporación

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

La microinyección de ADN en intranucleares disociada neuronas de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Investigación

Biología

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

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El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

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En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

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Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Evaluación de Generación de la Fuerza isométrica y excéntrica de los músculos esqueléticos Aislados de modelos murinos de Distrofias Musculares

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Imágenes en tiempo real de Soltero Engineered ARN transcritos en células vivas utilizando Ratiometric bimoleculares Balizas

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

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En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

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Detección y análisis de daño del ADN en el ratón músculo esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Con el método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...