Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

Vi tackar Dr T. Otis, Institutionen för neurobiologi, UCLA, för att dela TPLSM anläggningen med oss, Dr C. Fahlke, Institutet för fysiologi, RWTH Aachen, Tyskland, för den typ donation av pEYFP-ClC1 plasmid, och herr . R. Serrano för teknisk support. Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH / NIAMS bidrag AR047664 och AR54816.

Experimentella Rutiner för in vivo-elektroporering i FDB och IO muskler <ol><li> Innan in vivo elektroporering protokoll måste däggdjur uttryck plasmider förstärkas för att ge koncentrationen i intervallet på 2-5 mikrogram plasmid / l av TE. OBS: Vi rutinmässigt använder kommersiella förstärkning kit och följ tillverkarens förfaranden. Kommersiella uttryck plasmider som bär CMV promotor fungerar mycket bra i skelettmuskulatur in vivo transfections. </li><li> Alikvotera nödvän...

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

Vi beskriver här de detaljerade steg som bör följas för att uppnå en effektiv transfections av DNA plasmider i skelettmuskulaturen fibrer av in vivo-elektroporering. De största fördelarna med vår strategi är enkelheten i genomförandet, och dess minimala invasiv vilket resulterar i försumbar hälsorisk för djuren. I verkligheten innebär de ovan beskrivna elektroporation protokollen inte mycket mer än två subkutana injektioner per fot, följt av en elektrisk stimulering protokoll, som alla är väl...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Ett växande intresse för cellbiologi är att uttala transgenically modifierade former av viktiga proteiner (till exempel fluorescerande taggade konstruerar och / eller mutant varianter) för att undersöka deras endogena distribution och funktionell relevans. En intressant metod som har genomförts för att uppfylla detta mål fullt differentierade celler är<em&gt; In vivo</em&gt; Transfektion av plasmider med olika metoder i specifika vävnader såsom lever<sup&gt; 1</sup&gt;, Skelettmuskel<sup&gt; 2,3</sup&gt;, Och även hjärnan<sup&gt; 4</sup&gt;. Vi presenterar här en detaljerad beskrivning av de steg som måste följas för att effektivt transfektera genetiskt material in i fibrerna i<em&gt; Flexor digitorum brevis</em&gt; (FDB) och<em&gt; Interosseus</em&gt; (IO) musklerna i vuxna möss med hjälp av en<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporation tillvägagångssätt. Den experimentella parametrar har optimerats för att maximera antalet muskelfibrer transfekterade samtidigt minimera vävnad skador som kan försämra kvaliteten och kvantiteten av de proteiner som uttrycks i enskilda fibrer. Vi har kontrollerat att genomförandet av den metod som beskrivs i detta dokument ger en hög avkastning av lösliga proteiner, dvs EGFP och ECFP<sup&gt; 3</sup&gt;, Calpain, FKBP12, β2a-DHPR, etc. strukturella proteiner, dvs minidystrophin och α-actinin, och membranproteiner, dvs α1s-DHPR, RyR1, hjärt-Na / Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Värmeväxlare, NaV1.4 Na kanal SERCA1 etc. när de appliceras på FDB, IO och andra muskler av möss och råttor. Den effektiva av några av dessa proteiner har verifierats med biokemiska<sup&gt; 3</sup&gt; Och funktionella bevis<sup&gt; 5</sup&gt;. Men den i särklass vanligaste bekräftande metod som används av oss är vanliga lysrör mikroskopi och 2-fotonen laserskanning mikroskopi (TPLSM), som tillåter att identifiera inte bara de övergripande uttryck, men också den detaljerade intracellulär lokalisering av fluorescerande taggade proteinet konstruktioner. Metoden skulle kunna vara lika användas för att transfektera plasmider kodning för uttrycket av proteiner av fysiologiska betydelsen (som här), eller för störningar RNA (siRNA) som syftar till att undertrycka uttryck uttrycks normalt proteiner (ej testade av oss ännu). Det bör noteras att transfektion av FDB och IO muskelfibrer är särskilt relevant för utredningen av däggdjur muskelfysiologi sedan fibrer enzymatiskt tagit avstånd från dessa muskler är idag en av de mest lämpliga modeller för att undersöka grundläggande mekanismer retbarhet och excitation-kontraktion koppling i ström eller spänning klämma villkor<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Vi beskriver detaljerade förfaranden för effektiv transfektion av plasmid-DNA i fibrerna av mul muskler av levande möss med elektroporation och den efterföljande visualisering av protein uttryck med hjälp av fluorescensmikroskopi.

DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear mikroinjektion av DNA i dissocierade vuxna däggdjur Neuroner

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analys av DNA dubbel-strängen Break (DSB) Reparation i däggdjursceller

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo elektroporering av Morpholinos i Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex vivo Bedömning av kontraktilitet, fatigability och Alternans i isolerade skelettmuskler

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Isometrisk och excentrisk styrkebidragsprocessen Bedömning av muskler isolerat från musmodeller av muskeldystrofi

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Realtid avbildning av Single Engineered RNA transkript hos levande celler Använda Propportionell bimolekylär Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In vivo mikroinjektion och elektroporation av Mus Testikel

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detektion och analys av DNA-skador i Mouse skelettmuskulatur<em&gt; In situ</em&gt; Använda TUNEL metoden

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Granskning av proteiner bundna till Nascent DNA i däggdjursceller med användning BrdU-Chip-Slot-Western Teknik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...