Name: dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation
Uploaded: 2009-10-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

Dr T. Otis, Nörobiyoloji Bölümü, UCLA, Biz bize TPLSM tesis paylaşımı için teşekkür eder, Dr. C. pEYFP ClC1 plazmid tür bağış için Fahlke, Fizyoloji Enstitüsü, RWTH Aachen, Almanya, ve Sn. teknik destek için R. Serrano. Bu çalışma NIH / NIAMS hibe AR047664 ve AR54816 bağışları ile desteklenmiştir.

FDB ve IO kasları in vivo elektroporasyon Deneysel Prosedürler <ol><li> In vivo elektroporasyon protokolleri başlamadan önce, memeli ifade plazmid konsantrasyonu 2-5 mg / ul TE plazmid Not aralığında verim amplifiye olmalıdır: Biz rutin olarak ticari amplifikasyon kitleri kullanın ve üreticinin prosedürleri takip . In vivo transfections iskelet kası çok iyi CMV organizatörü çalışma taşıyan Ticari ifade plazmid. </li><li> Kısım plazmid çözüm gerekli...

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

Biz burada, in vivo elektroporasyon iskelet kas lifleri DNA plazmid etkili transfections ulaşmak için takip edilmesi gereken ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır . Yaklaşımın ana avantajı, uygulama kolaylığı ve hayvanlar için önemsiz sağlık açısından tehlike sonuçları minimal invazivlik. Gerçekte, yukarıda açıklanan elektroporasyon protokolleri anestezi altında hayvanlar tarafından iyi tolere edilen tüm elektrik stimülasyonu protokolü tarafından takip ayak başına iki subkutan e...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Hücre biyolojisi büyüyen bir ilgi endojen dağılımı ve fonksiyonel önemi araştırmak için gerekli proteinler (örneğin floresan etiketli yapıları ve / veya mutant türevleri) transgenically değiştirilmiş biçimlerini ifade etmek. Ilginç bir yaklaşım tamamen farklılaşmış hücrelerin bu amacı yerine getirmek için uygulamaya konmuştur.<em&gt; In vivo</em, Karaciğer gibi özel dokulara çeşitli yöntemlerle plazmid&gt; transfeksiyon<sup&gt; 1</sup&gt;, Iskelet kası<sup&gt; 2,3</sup&gt; Ve hatta beyin<sup&gt; 4</sup&gt;. Biz burada verimli lifleri genetik materyal transfect için takip edilmesi gereken adımları ayrıntılı bir açıklama mevcut<em&gt; Fleksör digitorum brevis</em&gt; (FDB) ve<em&gt; Interosseus</emBir yetişkin farelerin&gt; (IO) kaslar<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporasyon yaklaşım. Deneysel parametreleri tek fiber ifade proteinlerin nitelik ve nicelik bozabilir doku zedelenmelerinde en aza indirerek transfekte kas liflerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Biz bu yazıda anlatılan metodoloji uygulanması çözünür proteinlerin yüksek verim, yani EGFP ve ECFP sonuçları doğruladıktan<sup&gt; 3</sup&gt; Calpain, FKBP12, β2a DHPR, vb yapısal proteinleri, yani minidystrophin ve α-aktinin; ve membran proteinleri, yani α1s DHPR, RyR1, kardiyak Na / Ca<sup&gt; 2 +</supFDB, IO ve diğer kasların fare ve sıçanlarda uygulanan değiştirici, NaV1.4 Na kanal, SERCA1, vb. Bu proteinlerin bazı etkili ifade biyokimyasal ile onaylandı<sup&gt; 3</sup&gt; Ve fonksiyonel bir kanıt<sup&gt; 5</sup&gt;. Ancak, şimdiye kadar bize en sık kullanılan doğrulayıcı yaklaşım floresan etiketli protein yapıları standart floresan mikroskopi ve 2-foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM), sadece genel olarak ifade tanımlamak için izin verir, ama aynı zamanda detaylı intrasellüler localisation. (Burada görüldüğü gibi) ifade için fizyolojik ilgili proteinleri kodlayan plazmid transfect yöntemi eşit kullanılan ya da parazite RNA (siRNA) normalde ifade proteinleri (henüz test edilmedi) ifade bastırmak için amaçlayan olabilir. Bu kasların enzimatik ayrışmış liflerin altında temel uyarılabilirlik ve eksitasyon-kasılma kaplin mekanizmalarının araştırılması için şu anda en uygun modellerin biri olduğundan FDB ve IO kas liflerinin transfeksiyon memeli kas fizyolojisi soruşturma için özellikle ilgili olduğunu belirtmek gerekir akım veya gerilim kelepçe<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

İskelet Kası İzometrik ve Eksantrik Kuvvet Oluşturma Değerlendirme İzole Müsküler Distrofisi arasında murin Models

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...