Name: assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell
Uploaded: 2009-11-05T16:00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell at JoVE.com

<p class="jove_content"> Мы признаем, поддержки исследований по Внутренние программы исследований NIBIB, NIH. </p>

<p class="jove_title"> Пример Ассамблеи сотовый и крутящий момент </p><ol><li> Мы начинаем строительство кюветы, поставив вместе две сборки окна. <br /> Место окно прокладки в окно держателя. Расположите окна лайнера (или его иногда называют окном подушке) внутри окна держатель так, что открытие лайнера находится напротив паза владельца. Под небольшим углом, место окна в держатель выравнивания писец след в окно с ключевыми способ окна владельца. Пресс мягко на самых краев по обе стороны окна. </li><li> Для обеспечения надлежащей герметизации и точный крутящий момент в кюветы, мы слегка пальто прокладка жилья и винт кольцо с Spinkote смазки. Распространение очень небольшое количество Spinkote между большим и указательным пальцами. Резьбу винта кольца с тонкой, невидимой пленкой Spinkote. Кроме того, пальто жилья прокладки. Вытрите видимых смазки. </li><li> Начало сборки кюветы, сдвинув один оконный блок, с окном вверх по отношению к вам, в клетку жилья, совместив паз с жильем ключ. Выровнять по центральным пазом с жильем ключ и пусть она плавно опускаются на верхней части окна сборки внутри клетки. </li><li> Никогда не используйте какой-либо инструмент настаивать центральным в клетку жилья. Это может привести к необратимому повреждению СР в результате утечки в процессе экспериментов. Включите второй сборки окна так, чтобы окно, обращенной к центральным, вдали от вас, совместите паз с жильем ключ и сдвиньте ее вниз в верхней части центральной части. Место жилья прокладки на вершине, то, винт кольцо так, слово &quot;Out&quot; видна. С помощью пальцев и выравнивание инструмент, ручной затянуть винт кольца. <br /> Если СР не скользит легко в жилье баррель, во-первых выровнять его, а затем, место второго окне сборки на нем. Применяя нежный понижательное давление на оконный блок, слайд как в клетку жилья в то же время. Таким образом, мы избегаем нажатием непосредственно на CP. <br /> Сейчас самое подходящее время, чтобы заглянуть внутрь ячейки для пыли, пуха и отпечатки пальцев. Вы также заметите, кольца Ньютона, которые указывают на все еще воздух между СР и окон. Они будут исчезать после применения крутящего момента. </li><li> С винтом кольцо и слово «аут» видно, место кюветы весь путь вниз внутри цанги ячейки крутящий момент крутящий момент стенд. Держите ячейку в месте, применяя постоянное давление на ручку стоять крутящего момента. В одном непрерывном движении, затяните винт кольца между 120-140 дюйм-фунт. При использовании разводной ключ крутящего момента микрометра, установите его между 120-140 в / кг и затянуть винт кольцо, пока ключ &quot;клики&quot; с указанием множества крутящий момент была достигнута. Отпустите ручку крутящий момент встать и осторожно удалите кюветы, не касаясь окна. </li></ol><p class="jove_title"> Загрузка и уплотнительные кюветы </p><ol start="6"><li> Для экспериментов скорости седиментации, мы обычно нагрузка объемом 400ul в каждом секторе 12мм центральным использованием 200ul пипетки. Поместите кювету с загрузкой отверстий на верхней и слово «аут» на винт кольца видны. Слайд половину пипетки путь вниз в левый сектор центральным через загрузочный отверстия и медленно обойтись 200ul ведения решение. Повторите еще раз к общему 400ul. Используя тот же наконечник пипетки и ту же технику, тщательно и медленно заполнить правый сектор с центральным 400ul раствора пробы. <br /> Объемы 150-180 ул используются для экспериментов седиментации равновесия, но такой же тщательностью и техника должны быть соблюдены. <br /><br /> Крайне важно, чтобы соответствовать объемам ведения и образцы решений как можно ближе. Установка пипетки твердо на пипетку, медленно погрузки и выдачи решения, избегая загрузки пузырьков и с использованием тех же наконечником пипетки для обоих решений всей помощи в сохранении объемов как равные, насколько возможно. </li><li> Уплотнение ячейки путем размещения 2 новых красных прокладки корпуса разъема уютно в каждой загрузкой отверстие убедившись, что они расположены между центром и кусок алюминия. Обложка каждого корпуса разъема. Рука затянуть с небольшой плоской отверткой. </li></ol><p class="jove_title"> Пример сотовый Выравнивание в Ротор </p><ol start="8"><li> Перед загрузкой ротора, убедитесь, что противовеса составляет не более 0,5 г легче, чем образец ячейки в противоположную позицию в случае, если утечка кюветы. Начните с баланса на нуле. Первые весят кюветы, которые будут в положении противоположном ЦБ. Тара баланса вычесть вес образца ячейке, а затем, весят ЦБ. Сложение и вычитание веса от привязанности отверстие противовес. Убедитесь, что вес не выступают с самого верха. Reweigh для того, чтобы уравновесить конечный вес находится в пределах 0,5 г легче, чем противоположное ячейку образца. </li><li> Использование 4-местный ротор, место в противовес позиции 4 так, чтобы белая стрелка видна и указывая в тОн направлении центробежной силы. Убедитесь, что он все время вниз внутри ротора. Аккуратно закрепите винт, нашел на вершине противовеса через дорогу от белой стрелки, пока противовес прочно на месте, но все еще в состоянии быть выровнены. Позиция сбалансированной ячейки образца с жильем пробки перед центром ротора и слово «аут» на винт кольца видны. </li><li> Глядя из-под ротора, выравнивание внутри знак писцу (марка ближе к центру ротора) с писцом след в противовес использованием выравнивания разделов. Затяните винт для блокировки выровнены противовеса на месте. Таким же образом, выравнивание писец образца знаком ячейки с отметкой внутри писцом в позиции 2 на роторе. </li></ol><p class="jove_content"> Дополнительные сведения см. в <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a> </p>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Curr Protoc Immunol</em>. <b>Chapter 18</b>, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> <em style='font-style: italic'>Curr Protoc Immunol</em>. <b>Chapter 18</b>, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

<p class="jove_content"> Надлежащей сборке клетки, проба вставки и выравнивание ячеек в роторе имеет решающее значение для высокого качества экспериментов AUC. Это относится, в частности, для экспериментов, которые требуют очень детального анализа полученных данных по профилям макромолекулярных осаждения, например, при изучении белковых взаимодействий и определения следовых количествах совокупности. Зачастую качество экспериментальной установки является предельным для точности и точности результатов исследования AUC. Более подробную информацию о практической разработки и дальнейшего выполнения экспериментов AUC, см. ссылки 1 - 3. Семинары по практической установки, теории и анализа данных экспериментов AUC проводятся два раза в год в нашей лаборатории при Национальном институте здоровья [4]. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

<p class="jove_content"> Аналитической ультрацентрифуге (AUC) является мощным инструментом, который биофизических позволяет записывать профили макромолекулярных осаждения центрифугированием при высокой скорости. При правильно спланирована и проведена, скорости осаждения или AUC эксперимент седиментации равновесия может выявить много о белка в отношении размера и формы, образец чистоты, коэффициент седиментации, олигомеризации государств и белок-белковых взаимодействий. </p><p class="jove_content"> Этот метод, однако, требует строгого уровень технической внимания. Пример клетки провести секторный кусок центре между двумя сборками окна. Они запечатаны с крутящим моментом давлении около 120-140 в / кг. Буфера ведения и образец загружаются в центральную секторов, а затем после герметизации, клетки точно выстраиваются в титановой ротор так, чтобы оптические системы обнаружения сканирования и образцов и эталонов буфера в той же радиальной средней линии пути через каждый центральный сектор вращаясь со скоростью до 60 000 оборотов в минуту и ​​при очень высоком вакууме </p><p class="jove_content"> Мало того, что правильный монтаж ячейки образец критического, компоненты кюветы очень дороги и должны быть должным образом заботились, чтобы убедиться, что они находятся в оптимальном рабочем состоянии, чтобы избежать утечки и поломки в процессе экспериментов. Ручка окна тщательно, потому что даже малейшая трещина или царапина может привести к поломке в центрифуге. Контакта между центральным и окна должны быть как можно плотнее, т.е. кольца Ньютона не должны быть видны после крутящий момент давление. Пыль, волокна, царапины и масла с обеих окнах или центральным всех компромиссом этого контакта и может очень легко привести к утечке решений из одного сектора в другой или утечки из центральной все вместе. Мало того, что драгоценные образцы потеряли, утечки решений во время эксперимента вызовет дисбаланс давления в клетке, что часто приводит к разбитые окна и центральные части. Кроме того, плагин прокладки и жилищно зажигания должны быть надежно в месте, чтобы избежать решения время вытащил из центрального сектора через загрузку дырок высокого вакуума в камере центрифуги. Окно лайнеров и прокладки должны быть свободны от разрывов и трещин, которые могут вызвать движение в результате чего разбитые окна. </p><p class="jove_content"> Это видео будет демонстрировать наши процедуры образца сборки ячейки, крутящий момент, погрузки и ротора выравнивание чтобы свести к минимуму повреждения компонентов, решение утечки и поломки во время идеальный эксперимент AUC. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell at JoVE.com

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

<p class="jove_content">Аналитической ультрацентрифуге (AUC) образца ячейка содержит образцов и эталонов буфера и в ходе экспериментов и подвергается воздействию высокого вакуума и ротора со скоростью до 60000 оборотов в минуту. Это видео будет демонстрировать строгим вниманием к деталям необходимые для сборки, погрузки и выравнивание этого очень важная составляющая эксперимента AUC.</p>

Ассамблея, Загрузка и согласование аналитической сотовый Пример ультрацентрифуге

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Препарирование Организатор и эксплантов животных Полюс от Xenopus laevis Эмбрионы и Ассамблеи Пробирной клеточной адгезии

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Экс естественных механические нагрузки сухожилия

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro ядерной Ассамблеи Использование фракционированный яиц Xenopus Экстракты

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Ассамблея, настройка и использование Apertureless Near Field инфракрасный микроскоп для белка изображений

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Погрузка на грузовые кинезин Powered молекулярной Автобусы

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Аналитический инструмент, который количественно клеточные изменения морфологии от трехмерного изображения флуоресценции

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Опытные образцы для оптимизации STORM супер-разрешения микроскопии

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Генерация плазмидных векторов выражая флага меченных белков соответствии с Положением удлинения Человеческий фактор-1α промотора, используя Gibson Ассамблею

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Альтернативный подход к Подготовка проб с низкой Количество сотовых для анализа ПЭМ

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...