Name: assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell
Uploaded: 2009-11-05T16:00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell at JoVE.com

<p class="jove_content"> Vi erkänner den forskning stöd från Interna forskningsprogram NIBIB, NIH. </p>

<p class="jove_title"> Sample Cell Montering och Vridmoment </p><ol><li> Vi börjar byggandet prov cellen genom att sätta samman två fönster församlingar. <br /> Placera ett fönster packning i fönstret hållaren. Placera fönstret liner (eller det som ibland kallas ett fönster kudde) innanför fönstret hållaren så att öppnandet av liner är mittemot kilspår av innehavaren. Vid en liten vinkel, placera fönstret i hållaren anpassa skrivaren märket på fönstret med viktigt sätt i fönstret hållaren. Tryck försiktigt på mycket kanterna på båda sidor av fönstret. </li><li> För att säkerställa korrekt försegling och korrekt moment av provet cellen, vi lätt päls huset packningen och skruven ringen med Spinkote smörjmedel. Sprid en mycket liten mängd Spinkote mellan tummen och pekfingret. Stryk på tätningsmassa skruven ringen med en tunn, osynlig hinna av Spinkote. Likaså päls huset packningen. Torka bort synlig smörjmedel. </li><li> Börja monteringen prov cellen genom att skjuta ett fönster montering, med fönstret uppåt mot dig, in i cellen huset genom att rikta in kilspår med huset nyckeln. Justera mittpunkten kilspår med bostäder nyckeln och låt det försiktigt falla på toppen av fönstret monteringen inne i cellen. </li><li> Använd aldrig någon form av verktyg för att driva navet i cellen bostäder. Detta kan orsaka permanent skada på KP ger läcka under experiment. Slå det andra fönstret monteringen så att fönstret är vänd mot mittpunkten, bort från dig, anpassa kilspår med bostäder nyckel och skjut ner det på toppen av mittpunkten. Placera ett hölje packning ovanpå, då en skruv ringen så ordet &quot;Out&quot; är synlig. Använd dina fingrar och en anpassning verktyg, dra åt skruven ringen. <br /> Om CP inte glider lätt in i huset fat, först rikta in det då, placera det andra fönstret montering ovanpå det. Genom ett lätt tryck nedåt på fönstret montering, skjut både i cellen bostäder på samma gång. På detta sätt undviker vi att trycka direkt på CP. <br /> Nu är det dags att titta in i cellen för damm, ludd och fingeravtryck. Du kommer också att märka Newtons ringar som indikerar det fortfarande finns luft mellan KP och fönstren. Dessa försvinner efter att tillämpa vridmoment. </li><li> Med skruven ringa upp och ordet &quot;out&quot; synliga, placera provet cellen hela vägen ner inuti cellen vridmoment hylsan av vridmomentet monter. Håll cell på plats genom att konstant tryck på vridmomentet står handtaget. I en kontinuerlig rörelse, dra åt skruven ringen till mellan 120-140 in-lbs. Om du använder en skiftnyckel mikrometer vridmoment, ställ in den på mellan 120-140 i / kg och dra åt skruven ringen tills skiftnyckel &quot;klick&quot; som visar det inställda momentet har uppnåtts. Släpp handtaget vridmoment stå och dra försiktigt bort provet cellen utan att röra vid fönstren. </li></ol><p class="jove_title"> Lastning och Tätning Sample Cell </p><ol start="6"><li> För experiment sedimentering hastighet, last vi rutinmässigt en mängd 400ul i varje sektor av 12mm mittpunkten med hjälp av en 200ul pipett. Placera provet cellen med lastning hålen på topp och ordet &quot;out&quot; på skruven ringen synlig. Skjut pipetten sätt spetsen halv ner i vänster mittpunkten sektorn genom lastning hål och sakta avstå 200ul hänvisning lösning. Upprepa en gång till total 400ul. Med samma pipettspetsen och samma teknik, försiktigt och långsamt fyller RÄTT mittpunkten sektorn med 400ul av provlösningen. <br /> Volymerna av 150-180 ul används för experiment sedimentering jämvikt men samma omsorg och teknik bör följas. <br /><br /> Det är absolut nödvändigt för att matcha volymer av referens-och prov-lösningar så nära som möjligt. Montering pipettspetsen fast på pipetten, långsamt lastning och utlämning lösningar, att undvika lastning bubblor och med samma pipettspetsen för båda lösningarna alla stöd i att hålla volymerna så lika som möjligt. </li><li> Täta cellen genom att placera två nya röda packningar bostäder kontakten perfekt i varje lastning hål se till att de är placerade mellan centrum pjäs och aluminium bostäder. Täck varje med ett hölje plugg. Dra åt med en liten platt skruvmejsel. </li></ol><p class="jove_title"> Exempel Celljustering i Rotor </p><ol start="8"><li> Innan du laddar rotorn, se till motvikt är inte mer än 0,5 g lättare än provet cellen i motsatt position i fall att provet cellen läckor. Börja med balansen på noll. Först väger provet cell som skall vara i läge mittemot CB. Tare balansen för att subtrahera vikten prov cellen då väga CB. Lägg till eller ta bort vikt från fästhål av motvikt. Se till att vikterna inte sticker ut från toppen. Väg att säkerställa att den motvikt slutliga vikt är inom 0,5 g lättare än det motsatta prov cellen. </li><li> Med hjälp av en 4-plats rotor, placera en motvikt i position 4, så att den vita pilen syns och pekar på than riktning centrifugalkraft. Se till att det är hela vägen inne i rotorn. Försiktigt skruva ställskruven, som finns på toppen av motvikt mittemot den vita pilen, tills motvikt sitter stadigt på plats, men ändå kunna anpassas. Placera balanserade prov cellen med bostäder pluggar mot centrum av rotorn och ordet &quot;out&quot; på skruven ringen synlig. </li><li> Söker underifrån rotorn, rikta insidan skriftlärde märket (märket närmast centrum av rotorn) med skrivaren märket på motvikt med en justering verktyg. Dra åt ställskruven för att låsa linje motvikt på plats. På samma sätt, anpassa provet markera cellen skrivare med insidan skrivare märket på position 2 på rotorn. </li></ol><p class="jove_content"> För mer information se <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a> </p>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> <em style='font-style: italic'>Curr Protoc Immunol</em>. <b>Chapter 18</b>, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> <em style='font-style: italic'>Curr Protoc Immunol</em>. <b>Chapter 18</b>, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

<p class="jove_content"> Korrekt cellen montering, prov in, och celljustering i rotorn är avgörande för hög kvalitet AUC experiment. Detta gäller i synnerhet för experiment som kräver en mycket detaljerad analys av de förvärvade uppgifter om profilerna makromolekylära sedimentering, till exempel när man studerar proteininteraktioner och bestämma spårmängder aggregat. Ofta kvaliteten på experimentuppställning är begränsande för den noggrannhet och precision av resultaten från AUC studien. Mer information om den praktiska utformningen och vidare genomförande av AUC experiment, se Referenser 1 - 3. Verkstäder som täcker praktiskt setup, teori och analys av data från AUC experiment hålls två gånger per år i vårt laboratorium vid National Institutes of Health [4]. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

<p class="jove_content"> Den analytiska ultracentrifugen (AUC) är ett kraftfullt biofysiska verktyg som tillåter oss att spela in profiler makromolekylära sedimentering under hög hastighet centrifugering. När väl planerade och genomförda, kan en AUC sedimentering hastighet eller sedimentering jämvikt experiment avslöjar mycket om ett protein i fråga om att storlek och form, prov renhet, sedimentering koefficient, oligomerisering stater och protein-protein interaktioner. </p><p class="jove_content"> Denna teknik kräver dock en noggrann nivå av teknisk uppmärksamhet. Provkuvetterna hålla en sectored blickfång inklämt mellan två fönster församlingar. De är förseglade med ett vridmoment tryck på cirka 120-140 i / lbs. Referens buffert och prov laddas in i mittpunkten sektorer och sedan efter försegling, de celler exakt anpassat till en titan rotorn så att den optiska system för upptäckt skanna både prov och referens buffert i samma radiella väg mittlinjen genom varje mittpunkten sektorn samtidigt som roterar med hastigheter på upp till 60, 000 rpm och under mycket högt vakuum </p><p class="jove_content"> Inte bara är riktigt prov cell montering kritisk, prov cellens komponenter är mycket dyra och måste vara korrekt vårdas för att säkerställa att de är i optimalt skick för att undvika läckage och brott under experiment. Hantera fönster noggrant, även för de minsta spricka eller repa kan leda till brott i centrifugen. Kontakten mellan mittpunkten och fönster skall vara så strama som möjligt, dvs ingen Newtons ringar ska vara synlig efter vridmoment trycket tillämpas. Damm, ludd, repor och oljor på antingen Windows eller höjdpunkten alla kompromisser denna kontakt och kan mycket lätt leda till läckage av lösningar från en sektor till en annan eller läcker ut från mittpunkten alla tillsammans. Inte bara är dyrbara prover förlorade, läckande av lösningar under ett experiment kommer att orsaka en obalans av trycket i cellen som ofta leder till krossade fönster och centerpieces. Dessutom måste ansluta packningar och pluggar bostäder vara säkert för att undvika lösningar som drog sig ur mittpunkten sektorn genom lastning hålen av de höga vakuum i centrifugen kammaren. Fönster liners och packningar skall vara fria från brott och sprickor som kan orsaka som resulterar i trasiga fönster. </p><p class="jove_content"> Denna video kommer att visa våra rutiner prov cell montering, vridmoment, lastning och rotor anpassning för att minimera skador på komponenter, lösning läcker och brott under den perfekta AUC experimentet. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell at JoVE.com

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

<p class="jove_content">Den analytiska ultracentrifugen (AUC) prov cell innehåller prov och referens buffert och under experiment och utsätts för högt vakuum och rotor hastigheter upp till 60.000 rpm. Denna video kommer att visa de rigorösa uppmärksamhet på detaljer som behövs för montering, lastning och anpassningen av denna mycket viktiga del av en AUC-experiment.</p>

Montering, lastning och Uppriktning av en analytisk ultracentrifugen Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Dissekering av Organizer och Animal explants Pole från Xenopus laevis Embryon och församlingen i en cell Adhesion analys

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Ex vivo mekanisk belastning av senan

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

In Vitro Nuclear Assembly Använda Fraktionerade Xenopus Egg Utdrag

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

Montering, Tuning och användning av en Apertureless Near Field Infraröd Mikroskop för protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Lastning på Kinesin Powered Molekylär Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

Ett analysverktyg som kvantifierar cellulär morfologi Ändringar från Tredimensionella fluorescensbilder

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Promoter Using Gibson Assembly

Generation av plasmid vektorer som uttrycker FLAG-taggade proteiner Enligt förordningen om Human Förlängning Factor-1α Promoter Använda Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Ett alternativt tillvägagångssätt för provberedning med låg mobilnummer för TEM-analys

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...