Name: automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules
Uploaded: 2009-11-02T16:05:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules at JoVE.com

Мы благодарим Чандран Sabanayagam за помощь в разработке системы, Джошуа Эдель за советом по проектированию микрожидкостных устройств и сотрудников Rowland института Гарвардского университета для обработки деталей установки. Мы признаем, полезные обсуждения с членами группы Меллер по адресу Rowland института и Бостонского университета, и члены группы Т. Ха &quot;с при UIUC для полезной информации. Наконец, мы ценим финансовой поддержке Национального научного фонда (PHY-0701207) и Национального Института Здоровья (GM075893).

1 - Сборка микрожидкостных ячейки Микрожидкостных ячейки производится путем слияния с рисунком, толщиной 2 мм, полидиметилсилоксан (PDMS) диск только что очищенный кварц скольжения покрытия. PDMS диск содержит четыре 30 мкл прямоугольных камерах, к которым обращаются входе и выходе гибкие капилляры связано с резервуаром буфера и шприцевой насос, соответственно, для контролируемого потока буфера. Проточной ячейке поддерживается на ее обратной стороне на оконное стекло и помещен на заказ ячейкой содержащей водяным охлаждением термоэлектрический элемент для регулирования температуры. <ol><li> Для того, чтобы узорной PDMS диск, смешать 10 частей силиконового эластомера базу с 1 частью отвердителя, тщательно перемешать и оставить дегазации в течение 1 часа в вакууме. </li><li> Осторожно вылейте смесь эластомера на микрожидкостных форму клетки. В нашем случае это 1 &quot;кремниевой пластины с четырьмя полосами (1x10 1x10 4 х 3 х 300 мкм) из отрицательного фоторезиста. Оставьте это вылечить на горячей плите при температуре 70 ° С в течение двух часов. </li><li> Тщательно очистите вылечить PDMS диск из форм использования лезвия бритвы. Предохранитель диска на 1&#39;&#39;стекла (содержащий 8 х 2 мм в диаметре предварительно просверленные отверстия на обоих концах канала) плазмой окислительных обе поверхности в течение 30 секунд. Предохранитель стекла на плоской стороной диска PDMS (сторона не содержащие каналов). </li><li> Вставьте 2-дюймовый длинный гибкий плавленого кварца капиллярную трубку через отверстие каждый стакан окна, пока не достигнет канала. Вставка иглы, а затем следующие с капиллярной могут облегчить этот процесс. Уплотнение стекла отверстия с помощью быстрого отверждения силиконового литья соединения, такие как Kwik-Cast. </li><li> Промыть каналов с этанолом и водой, и плазменно-активировать камере вместе с только что очищенный, 1-дюймовый круговой кварца скольжению покрытие в течение 30 секунд. Мы предлагаем очистку это покрытие скольжения использованием пираньи *. Предохранитель покровным стеклом в сторону ячейки, содержащей каналы, герметизация камер. </li><li> Оставьте собрал ячейки вылечить в течение ночи при комнатной температуре. </li></ol> * Piranha является решением H 2 O 2 и H 2 SO 4 в 1:2.5 пропорциях. Для очистки крышка скользит, погрузите их в пираний при 90 ° С в течение 20 мин. 2 - активация поверхности для иммобилизации молекул Для исследования нуклеиновых кислот, Простейшая схема поверхности иммобилизации состоит из первого слоя стекла или кварца скольжения накрыть биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем стрептавидином. Это позволяет биотинилированного образца будет заблокирован с высокой специфичностью в течение нескольких дней при комнатной температуре. <ol><li> Подключите гибкий шланг с капиллярами для легкой инъекции буфера с помощью шприца и иглы. </li><li> Inject раствор 0,1 мг / мл биотинилированного БСА в буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, фильтруется с помощью фильтра 0,02 мкм) в канал и инкубировать в течение 30 мин. </li><li> Поток 300-500 мкл буфера для удаления любых свободных биотинилированного BSA из канала, стараясь не поймать пузырьки воздуха внутри камеры. </li><li> Inject раствор 0,1 мг / мл в буфере стрептавидином и инкубировать в течение 15 мин. Затем повторите шаг 3. </li><li> Поток через 3-5 рМ решение биотинилированного образца. Выполните проверку поверхности и проверить освещение флуоресцентными молекулами. При необходимости увеличивают концентрацию образца для получения лучшего покрытия сетей. Инкубируйте в течение 10 минут и повторите шаг 3. </li></ol> Микрожидкостных ячейка монтируется на этапе моторизованных ху позволяет грубые (до 25 мм), движения с помощью оптически закодированные двигатели постоянного тока, и мелкие (1 нм) движение с помощью двух замкнутых пьезоэлектрические приводы (Physik Instrumente модели М-014 или аналогичные). Это можно сделать либо до, либо после активации поверхности образца иммобилизации. 3 - Подготовка буфера изображений (IB) IB состоит из кислорода ферментативной очистки системы и триплетного тушителя, таких как Trolox. С IB сбрасывается через постоянно на ночь, не менее 10 мл должны быть подготовлены заранее. <ol><li> Подготовка 10 мл 0,8% м / о D-глюкозы, по крайней мере 35 мМ Трис-HCl рН 8,0 и 50 мМ NaCl в деионизованной воде. Чем выше концентрация буфера важно по двум причинам: растворение Trolox будет окисляться решение, и ферментативной реакции будет также ниже рН раствора с течением времени. Так как это решение имеет длительный срок хранения может быть сохранен как маточный раствор. </li><li> Растворите 5 мг Trolox в буфер, подготовленный в шаге 1 на вортексе в течение нескольких минут, а затем встряхивания в течение&gt; 10 мин. Trolox не очень хорошо растворяется в воде при рН&gt; 7, поэтому не спешите этого шага. Фильтры решения с использованием 0,2 мкм и оставить дегазации в вакууме в течение 10 минут. </li><li> Подготовка &quot;gloxy&quot; ферментативных решение путем смешивания 60 мкл Уотг, 20 мкл 5X буфера, 20 мкл каталазы, 1 мг оксидазы глюкозы и 100 мкл 10 мг / мл BSA. Фильтры решения с использованием 0,22 мкм центрифуги фильтр. </li><li> Аккуратно перемешайте буфер, начиная с шага 2 с &quot;gloxy&quot; решение с шага 3 избегая образования воздушных пузырей. </li><li> Поток IB через канал с постоянной скоростью 5 мкл / мин с использованием механических насосов шприца для контроля расхода. Bubble аргона в IB резервуар для предотвращения кислородом воздуха от повторного растворения в буфер. </li></ol> Сканирования поверхности, локализацию молекулы и приобретение одного следы интенсивности молекула находится под контролем программы LabView, которая позволяет автоматизированного сбора данных 1. Программа сканирует 20x20 мкм 2 областях на 0,2 мкм резолюцию, со скоростью 0,1 мкм / мс. Данные сразу же обрабатываются для получения интенсивности-взвешенный расположение всех пикселей выше фона имеет значение. После иммобилизованных молекул будут найдены, они перемещаются по одному в конфокальной объема и интенсивности донора и акцептора флуорофора регистрируются как функция времени, пока обе photobleach флуорофоров. Стадия затем запрограммировать на переход к новой происхождения 100 мкм далеко, и процесс сканирования повторяется. 4 - представитель Результаты Ниже приведены некоторые изображения, показывающие собравшихся микрожидкостных клетке до активации поверхности и после того, установлен на микроскоп готов к молекуле иммобилизации. Если канал успешной активации, сканирует поверхность должна быть похожа на сканирование показано ниже показаны выбросы доноров красителя (зеленый) и акцепторных (красный) после прямого возбуждения донора. Эти молекулы перемещаются по одному в зондировании объем и флуоресценции регистрируется в течение долгого времени, пока обе photobleach красители, как показано на одном следы молекулы. Из следов подобных можно получить FRET эффективность, которая сообщает о мгновенной донорно-акцепторных разделение, которое в свою очередь, используется для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Рисунок 1" border="0" /> Рисунок 1: микрожидкостных клетка с четырьмя каналами, каждый из которых вход / выход капилляров. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">нажмите здесь</a> , чтобы видеть большую версию рисунке 1. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Рисунок 2" border="0" /> Рисунок 2: Сотовый установлен на микроскоп готов к измерениям. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">нажмите здесь</a> , чтобы видеть большую версию рисунке 2. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Рисунок 3" border="0" /> Рисунок 3: Настройка для SM-FRET измерений. Пожалуйста, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">нажмите здесь</a> , чтобы видеть большую версию рисунке 3. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Рисунок 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Рисунок 5" border="0" /> На рисунках 4 и 5: Красный и зеленый канал сканирования поверхности иммобилизованных FRET молекул, возбужденных с зеленым лазером. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">рисунке 4</a> , или <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">рисунке 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Рисунок 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Рисунок 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Рисунок 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Рисунок 9" border="0" /> 6, 7, 8 и 9: Интенсивность траектории донора (зеленый) и акцепторных (красный) флуорофоров маркированы, чтобы молекулы ДНК 8, 10, 16 и 18 пар оснований друг от друга. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">рисунок 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">рисунок 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">рисунок 8</a> , или <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">на рисунке 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Хотя приведенный выше протокол был оптимизирован для нашей конкретной системы и конкретного выбора красителей (ПМР и ATTO647N), это отнюдь не только доказал методом. В последнее время альтернативные поглощающего кислород система, состоящая из протокатеховая кислоты (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PCD) было показано, что увеличение фотостабильности некоторых красителей 4. Кроме того, другие триплетного состояния жажду, таких как β-меркаптоэтанола (BME) может быть использован вместо Trolox, хотя они не могут подавить длительного мигание некоторых красителей, в частности Cy5 5. Хотя иммобилизации с помощью биотин-стрептавидин-биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) является предпочтительным выбором для исследования нуклеиновых кислот, полиэтиленгликоля (PEG)-покрытием лучше подходит для исследования белков, поскольку она препятствует неспецифической адгезии 1. Кроме того, к югу от дифракционной пузырьки размер может быть использован для инкапсуляции биомолекулы интересов в случаях, когда это может повлиять на поверхности взаимодействия 6. В этой статье мы использовали конфокальной установка оснащена силиконовыми лавинных фотодиодов приобрести флуоресценции следы интенсивности. Этот протокол работает одинаково хорошо с полным внутренним отражением флуоресцентный микроскоп (TIRF), оснащенных ПЗС-камер. Независимо от того, использовали микроскопию, см-FRET можете сообщить по пространственным разрешением приближается ангстрем, когда донор и акцептор сигнал должным образом исправлены 7.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Резонансной флуоресценции передачи энергии (FRET) микроскопия нашла широкое применение для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса, такие, как нуклеиновые кислоты и белки. Одноместный молекулы FRET (см-FRET) измерений на иммобилизованных молекул разрешения длительные наблюдения системы эффективно, пока обе красителей photobleach-в результате чего время-следы, что отчет о динамике биомолекулярных с широким спектром временных масштабах от миллисекунд до нескольких минут. Для облегчения приобретения большого количества следов для статистического анализа, процесс должен быть автоматизирован и окружения образца должны быть под жестким контролем в течение всего времени измерений (~ 12 часов). Это достигается с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии, который позволяет допроса тысяч одиночных молекул в одночасье, и микрожидкостных клетка, которая позволяет контролируемого обмена буфера, с ограниченным содержанием кислорода и поддерживает постоянную температуру на протяжении всего периода измерения. Здесь мы показываем, как собрать микрожидкостных устройств и инструкции по активации ее поверхности для иммобилизации ДНК. Затем мы объясняем, как подготовить буфер для максимально фотостабильности и срок службы флуорофоров. Наконец, мы покажем этапы подготовки установки для автоматизированного приобретения с временным разрешением одной молекулы FRET следы молекул ДНК.

Watch this Scientific Journal Video about Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules at JoVE.com

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

В этой статье мы опишем, как мы получаем FRET следы от отдельных молекул ДНК, иммобилизованных на поверхности с помощью автоматизированной сканирующей конфокальной микроскопии.

Автоматизированная система для одной молекулы флуоресцентной Измерения поверхностного иммобилизованных биомолекул

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Одноместный Методы Молекула для мониторинга изменений в двухслойных упругих свойств

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Antifouling Self-assembled Monolayers on Microelectrodes for Patterning Biomolecules

Antifouling самоорганизующихся монослоев на микроэлектродов для структурирования биомолекул

We present a procedure for forming a poly(ethylene glycol) (PEG) trimethoxysilane self-assembled monolayer (SAM) on a silicon substrate with gold ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Визуализация одиночных молекул ДНК репликации с помощью флуоресцентной микроскопии

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Одиночных молекул изображений ядерного транспорта

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Полуавтоматическая изображений тканеспецифических флуоресценции у эмбрионов данио рерио

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Изучение ДНК Looping на одиночных молекул FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source High Content Analysis Используя Автоматизированное время жизни флюоресценции визуализации микроскопии

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Метод для маркировки стенограммы в клетках отдельных кишечная палочка для одной молекулы флуоресценции в Situ гибридизация экспериментов

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Изоляция и флуоресценции изображений для одной частицы реконструкция Хламидомонада Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...