Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

الكتاب أود أن أشكر الدكتور شينج دينج من معهد سكريبس للبحوث والدكتور دنغ Hongkui من جامعة بكين للحصول على المساعدة والتوجيه.

1. إعداد لوحات التغذية MEF <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم واحد الخلايا ES زراعة ، أذاب one قنينة من E14.5 المشع CF - 1 الخلايا المغذية MEF (انظر إجراءاتنا بشأن كيفية أذاب خلايا ES). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة MEF المغذية للخلايا في مناطق ذات كثافة من 10000 خلية / كذلك في لوحة 12 أيضا. احتضان الخلايا ليلا 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. MEF الخلية وسائل الإعلام : DMEM تستكمل مع 10 ٪ ES - برنامج تلفزيوني ، والجلوتامين 1X 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية. </li></ol> 2. الحفاظ على التجديد الذاتي للخلايا ES ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا ES باستخدام التربسين. بذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 50000 خلية / كذلك على لوحات معدة مسبقا MEF تغذية النمو في وسائل الإعلام (MEM خروج المغلوب تستكمل مع KSR 15 ٪ ، 4 مم الجلوتامين L - ، 0.1 ملم غير الاساسيين من الأحماض الأمينية وBME 1X) تستكمل مع SC1 على التركيز المطلوب (100 نانومتر كنا ، NM 300 ، وميكرومتر 1). علينا أيضا أن أضيف مراقبة إيجابية جيدا أن استكمل مع 1000 μ / مل من LIF. احتضان الخلايا ليلا 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 لمدة 3-4 أيام في كل عبور. تحديث وسائل الإعلام كل 48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا مرور 1:10 حتي 1:15 التربسين مع الحفاظ على كثافة مماثلة لكثافة الغرس الأولي. بعد 5 فقرات ، يمكن فحص الخلايا للتعبير عن علامات تعدد القدرات باستخدام كيمياء سيتولوجية مناعية نموذجية. </li></ol> 3. Immunocytochemical فحص علامات تعدد القدرات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا مع 500 ميكرولتر من مثبت لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة غير محددة وملزمة مع العازلة ميكرولتر 500 حظر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية محددة (كنا Nanog ، Sox2 ، SSEA1 وOct4 في التخفيفات التالية : 1:500 ، 1:2000 ، 1:500 ، و1:500) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ، والابتعاد عن الضوء (استخدمنا الحمير لمكافحة فأر مترافق مع فلور اليكسا ® 555 في 1:2000 والحمار المضادة للأرنب مترافق مع فلور اليكسا ® 488 في 1 : 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة دابي (تركيز النهائي 1 ميكروغرام / مل) لغسل الماضي ، واحتضان 5 دقائق لتصور النوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الخلايا تحت المجهر الفلورسنت. </li></ol> 4. ممثل النتائج : 1. مورفولوجيا النتائج : ونمت الخلايا الماوس ES (ESC R1) على الخلايا المغذية MEF في وجود إما LIF SC1 أو للحفاظ على الذات في تجديد حالة غير متمايزة. بعد مرور الثانية ، يمكن ملاحظة التمايز في الخلايا دون LIF أو SC1 (السيطرة السلبية) ، وبعد 5 الممرات وقد لوحظت في الأساس ليست مستعمرات غير متمايزة. بقي LIF (مراقبة إيجابية) مستعمرات تعامل في حالة غير متمايزة في جميع أنحاء الممرات الخلية 5. خلايا تعامل مع SC1 بتركيزات من 300 نيوتن متر أو 100 نانومتر كما بقيت غير متمايزة بعد 5 الممرات ، ومع ذلك ، فإن الخلايا المعالجة مع 1 ميكرومتر SC1 شهدت موت الخلية بعد مرور الرابع. (أنظر الشكل 2 من مذكرة التطبيق) ويلخص الجدول 1 الملاحظات الشكلية. 2. التعبير عن علامات تعدد القدرات تم إصلاح خلايا الفأر ES المحافظة لمدة 5 الممرات وفحصها للكيمياء سيتولوجية مناعية SSEA1 ، Nanog ، وOct4 Sox2. وكان التعبير علامة مشابهة للخلايا في الحفاظ LIF. (أنظر الشكل 3 و 4 من مذكرة التطبيق) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 : مقارنة مورفولوجيا الخلايا أو الاحتفاظ بها في LIF SC1. لم يلاحظ أي اختلاف في التشكل. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="الشكل 2 و 3" /> الشكل 2 والشكل 3 : Nanog ، SSEA1 ، Sox2 ، وتلطيخ Oct4 الخلايا الحفاظ على وفاق مع SC1 أو LIF (التين 4 من مذكرة التطبيق). في الحفاظ على خلايا مماثلة التعبير SC1 تظهر علامة على الخلايا الحفاظ على تعدد القدرات في LIF. الجدول 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> التحكم السلبي </td><td> LIF التحكم ايجابي </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 نانومتر </td><td> SC1 100 نانومتر </td></tr><tr><td> 1 الممر </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td></tr><tr><td> 2 الممر </td><td> بعض مورفولوجيا متباينة </td><td> البريد العاديS خلية مورفولوجيا </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td></tr><tr><td> 3 ممر </td><td> الغالبية العظمى من الخلايا المتمايزة </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td></tr><tr><td> 4 ممر </td><td> لا مستعمرات ESC </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> لوحظ موت الخلية </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td></tr><tr><td> 5 الممر </td><td> متمايزة </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> لوحظ موت الخلية </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td><td> مورفولوجيا الخلايا العادية ES </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

ويعمل واضعو هذه المادة التي تنتج Stemgent الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

يمكن استخدام SC1 جزيء صغير للحفاظ على الذات التجديد مع دولة غير متمايزة في الخلايا ES الماوس. قبل استخدام على خط الخلية التي لم تختبر ، ومع ذلك ، ينبغي معاير لتحديد تركيز الأمثل. على سبيل المثال ، نحن اختبار ثلاثة تركيزات على الخلية ES الماوس R1 ESC الخط. 100 نانومتر و 300 نانومتر التركيزات كانت قادرة على الحفاظ على خلايا ES الماوس ، ومع ذلك ، كان التركيز فيها 1 ميكرومتر السامة. ويمكن أيضا أن تستخدم تحت SC1 تغذية خالية من الشروط.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

تستزرع تقليديا الماوس الجذعية الجنينية (ES) مع خلايا اللوكيميا عامل المثبط (LIF) للحفاظ على الذات التجديد.<sup&gt; 1</sup&gt; ومع ذلك ، LIF مكلفة وليس تفعيل المسار LIF/JAK/STAT3 المطلوب تماما للحفاظ على حالة التجديد الذاتي.<sup&gt; 2</sup&gt; قد يكون جزيء صغير SC1 بديلا اقتصاديا لLIF. وظائف عن طريق تثبيط SC1 المزدوج للرأس وجاب ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; رسم توضيحي لآلية عملها يجعلها أداة مفيدة لدراسة الآلية الجزيئية الأساسية التجديد الذاتي. نحن هنا لشرح الداخلي للخلايا الفأر في زراعة وفاق وجود SC1 وتظهر أنها قادرة على الحفاظ على تجديد الذاتي في غياب LIF. وأظهرت الخلايا المستزرعة مع SC1 التشكل مماثلة مقارنة مع المحافظة على الخلايا LIF. عرضت كلا نموذجي مورفولوجيا ES الماوس بعد خمس فقرات. ولوحظ تعدد القدرات التعبير عن علامات نموذجي (Oct4 ، Sox2 ، Nanog وSSEA1) بعد خمس فقرات في حضور SC1. وعلاوة على ذلك ، تسبب أي سمية SC1 العلني على خلايا ES الماوس.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

وظائف عن طريق تثبيط SC1 المزدوج للرأس وجاب ERK1. نحن اختبار وظيفة SC1 في دعم خلية فأر ES التجديد الذاتي في غياب LIF وأظهرت أن SC1 غير قادرة على الحفاظ على الذات تجديد الخلايا ES الثقافات الماوس.

استخدام SC1 (Pluripotin) لدعم MESC التجديد الذاتي في غياب LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

استخدام بيوفيدباك في الواقع الافتراضي السريرية : مشروع مقدام

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP الفحص مراسل لدراسة الجينات التي تنظم الفأر الخلايا الجذعية الجنينية الصيانة والتجديد الذاتي

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

استخدام الكيموستات في الميكروبية بيولوجيا الأنظمة

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

استخدام الأنزيمية أجهزة الاستشعار لقياس الذاتية ATP أو H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; في الكلى

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

استخدام<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التصوير الجامع بالأعضاء والأنسجة الكمي الأنسجة لتحديد بيو توزيع الجزيئات Fluorescently إعتبر

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...