Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

De auteurs willen dr. Sheng Ding van het Scripps Research Institute en Dr Hongkui Deng van de Universiteit van Peking bedanken voor hun hulp en richting.

1. Voorbereiding van de MEF feeder platen <ol><li> Een dag voor het kweken van embryonale stamcellen, dooi een flacon van bestraalde E14.5 CF-1 MEF feeder-cellen (zie onze procedure voor het ES-cellen ontdooien). </li><li> Het bord van de MEF feeder-cellen bij een dichtheid van 10.000 cellen / putje in een 12 wells plaat. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO 2. MEF cel media: DMEM aangevuld met 10% ES-PBS, 1X glutamine en 1X niet-essentiële aminozuren. </li></ol> 2. Onderhoud van Self-Vernieuwing van muis ES cellen <ol><li> Maak de ES-cellen met behulp van trypsine. Zaad van de cellen bij een dichtheid van 50.000 cellen / goed op de vooraf bereide MEF feeder platen in de groei media (Knockout MEM aangevuld met 15% KSR, 4 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren en 1X BME), aangevuld met SC1 op de gewenste concentratie (gebruikten we 100 nM, 300 nM, en 1 uM). We hebben ook nog een positieve controle goed, dat werd aangevuld met 1000 μ / ml LIF. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Cultuur de cellen bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 3-4 dagen per passage. Refresh media om de 48 uur. </li><li> Passage cellen 1:10-tot-1:15 met trypsine om een ​​soortgelijke dichtheid als de eerste seeding dichtheid te behouden. Na vijf passages, kunnen de cellen worden onderzocht voor de expressie van de typische pluripotentie markers met behulp van immunocytochemie. </li></ol> 3. Immunocytochemische Onderzoek van pluripotentie Markers <ol><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Fixeer de cellen met 500 pi van fixatief gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Blokkeer niet-specifieke binding met 500 ul blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer de cellen met 250 pi van de specifieke primaire antilichaam (wij gebruikten NANOG, Sox2, SSEA1, en Oct4 op de volgende verdunningen: 1:500, 1:2000, 1:500 en 1:500) </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Incubeer de cellen met 250 ul van secundaire antilichaam voor twee uur bij kamertemperatuur, waardoor uit de buurt van licht (wij gebruikten ezel anti-muis-geconjugeerd met Alexa Fluor ® 555 bij 1:2000 en ezel anti-konijn geconjugeerd met Alexa Fluor ® 488 op 1 : 2000). </li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS. </li><li> Voeg DAPI (eindconcentratie 1 ug / ml) tot de laatste wassen en incubeer 5 minuten kernen te visualiseren. </li><li> Analyseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: 1. Morfologie resultaten: Muis ES-cellen (ESC R1) werden gekweekt op MEF feeder cellen in de aanwezigheid van een van beide LIF of SC1 om zelf-vernieuwing te ondersteunen in een ongedifferentieerde staat. Na de tweede passage, kan onderscheid worden waargenomen in cellen zonder LIF of SC1 (negatieve controle) en na vijf passages in wezen geen ongedifferentieerde kolonies werden waargenomen. LIF (positieve controle) behandeld kolonies bleven in een ongedifferentieerde staat gedurende de 5 cel passages. Cellen behandeld met SC1 bij concentraties van 300 nM of 100 nM ook ongedifferentieerde bleef na vijf passages, maar de cellen behandeld met 1 uM SC1 ervaren celdood na de vierde passage. (Fig. 2 van de app note) Tabel 1 geeft een overzicht van de morfologische waarnemingen. 2. Expressie van pluripotentie Markers Muis ES-cellen gedurende vijf passages waren vastgesteld en onderzocht door middel van immunocytochemie voor SSEA1, Oct4, NANOG en Sox2. Marker uitdrukking was gelijk aan cellen behouden in LIF. (Fig 3 en 4 van app noot) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1: Morfologie vergelijking van de cellen die gehandhaafd in LIF of SC1. Geen verschil in morfologie waargenomen. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Figuur 2 en 3" /> Figuur 2 en Figuur 3: NANOG, SSEA1, Sox2 en Oct4 kleuring van ES-cellen onderhouden met SC1 of LIF (fig 4 van ca. noot). Cellen gehandhaafd in SC1 Toon vergelijkbaar pluripotentie marker expressie aan cellen behouden in LIF. Tabel 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negatieve controle </td><td> LIF positieve controle </td><td> SC1 1uM </td><td> SC1 300 nM </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1e Passage </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 2e Passage </td><td> Sommige gedifferentieerde morfologie </td><td> Normaal ES celmorfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 3e Passage </td><td> Meerderheid van de gedifferentieerde cellen </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 4e Passage </td><td> Geen ESC kolonies </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Celdood waargenomen </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr><tr><td> 5e Passage </td><td> gedifferentieerd </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Celdood waargenomen </td><td> Normale ES-cel morfologie </td><td> Normale ES-cel morfologie </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

De auteurs van dit artikel zijn in dienst van Stemgent dat de reagentia en instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

De kleine molecule SC1 kan worden gebruikt om zelf-vernieuwing te onderhouden met een ongedifferentieerde staat in de muis ES-cellen. Bij gebruik op een niet-geteste cellijn, echter, moet worden getitreerd tot de optimale concentratie te bepalen. Bijvoorbeeld, we getest drie concentraties op de muis ES-cellijn ESC R1. 100 nM en 300 nM waren de concentraties in staat om de muis ES cellen te ondersteunen, maar een 1 uM concentratie giftig. SC1 kan ook worden gebruikt onder feeder-vrije omstandigheden.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

Muis embryonale stamcellen (ES)-cellen zijn conventioneel gekweekt met Leukemie-remmende factor (LIF) om zelf-vernieuwing te behouden.<sup&gt; 1</sup&gt; Echter, LIF is duur en activering van de LIF/JAK/STAT3 pad is niet absoluut nodig is om de zelf-vernieuwing status te behouden.<sup&gt; 2</sup&gt; De SC1 kleine molecuul kan een economisch alternatief voor LIF worden. SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Illustratie van het werkingsmechanisme is het een nuttig instrument om de fundamentele moleculaire mechanisme van zelf-vernieuwing te bestuderen. Hier laten we zien de procedure voor het kweken van muizen ES-cellen in de aanwezigheid van SC1 en laten zien dat ze in staat zijn om zelf-vernieuwing te behouden in de afwezigheid van LIF. Cellen gekweekt met SC1 toonde vergelijkbare morfologie in vergelijking met cellen die onderhouden met LIF. Beide tentoongesteld typische muis ES morfologie na vijf passages. Expressie van typische pluripotentie markers (Oct4, Sox2, NANOG en SSEA1) werd waargenomen na vijf passages in de aanwezigheid van SC1. Bovendien, SC1 veroorzaakte geen openlijke toxiciteit op de muis ES-cellen.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1. We testten de functie van SC1 in de ondersteuning van muis ES-cel zelf-vernieuwing in de afwezigheid van LIF en liet zien dat SC1 in staat is om zelf-vernieuwing van de muis ES-celculturen te behouden.

Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Gebruik van de Protease Fluorescerende Detection Kit om Protease activiteit te bepalen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Het gebruik van biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Het gebruik van chemostaten in Microbiële Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Gebruik<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Als een modelsysteem voor de Protein Homeostase studeren in een meercellige

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Het gebruik van enzymatische biosensoren te kwantificeren endogene ATP of H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; In de nier

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Het gebruik van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...