Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

Die Autoren möchten Dr. Sheng Ding vom Scripps Research Institute und Dr. Hongkui Deng von der Peking-Universität für ihre Unterstützung und die Richtung zu danken.

1. Vorbereitung der MEF Feeder-Platten <ol><li> Einen Tag vor Kultivierung ES-Zellen, Tauwetter ein Fläschchen von bestrahlten E14.5 CF-1 MEF Feeder-Zellen (siehe unsere Vorgehensweise zum ES-Zellen auftauen). </li><li> Platte der MEF Feeder-Zellen bei einer Dichte von 10.000 Zellen / Well in einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. MEF Zellen Medien: DMEM mit 10% ES-PBS, 1X Glutamin und 1X nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt. </li></ol> 2. Wartung von Self-Erneuerung der Maus ES-Zellen <ol><li> Lösen Sie die ES-Zellen unter Verwendung von Trypsin. Seed die Zellen bei einer Dichte von 50.000 Zellen / well auf die zuvor vorbereiteten MEF Feeder-Platten in Nährmedien (Knockout MEM mit 15% KSR, 4 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1X BME ergänzt) mit SC1 ergänzt in der gewünschten Konzentration (wir haben 100 nM, 300 nM und 1 pM). Außerdem haben wir eine positive Kontrolle gut, dass mit 1000 μ / ml LIF ergänzt wurde. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Kultur der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3-4 Tage in jedem Durchgang. Refresh Medien alle 48 Stunden. </li><li> Passage-Zellen von 1.10 bis 01.15 Uhr mit Trypsin ein ähnlicher Dichte wie die erste Aussaatdichte aufrecht zu erhalten. Nach 5 Passagen, können die Zellen auf die Expression von typischen Pluripotenz Marker mit Immunzytochemie untersucht werden. </li></ol> 3. Immunzytochemische Untersuchung der Pluripotenz Markers <ol><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Fix die Zellen mit 500 ul Fixativ für 20 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Block unspezifische Bindung mit 500 ul Blockierungspuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des spezifischen primären Antikörper (wir Nanog, Sox2, SSEA1 und Oct4 bei den folgenden Verdünnungen: 1:500, 1:2000, 1:500 und 1:500) </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit 250 ul des sekundären Antikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur, hielten sich fern von Licht (wir haben Esel anti-Maus konjugiert mit Alexa Fluor ® 555 bei 1:2000 und Esel-anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor ® 488 bei 1 : 2000). </li><li> Waschen Sie die Zellen vorsichtig dreimal mit PBS. </li><li> Add DAPI (Endkonzentration 1 pg / ml) auf dem letzten Waschen und Inkubation 5 Minuten, um Kerne zu visualisieren. </li><li> Analysieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: 1. Morphologie Ergebnisse: Maus ES-Zellen (ESC R1) wurden am MEF Feeder-Zellen in Anwesenheit von entweder LIF oder SC1 gewachsen zu Selbst-Erneuerung in einem undifferenzierten Zustand halten. Nach dem zweiten Durchgang konnte die Differenzierung in Zellen ohne LIF oder SC1 (negative Kontrolle) beobachtet werden und nach 5 Passagen im Wesentlichen keine undifferenzierte Kolonien beobachtet wurden. LIF (positive Kontrolle) behandelt Kolonien blieb in einem undifferenzierten Zustand in den 5 Zellpassagen. Zellen, die mit SC1 in Konzentrationen von 300 nM oder 100 nM behandelt blieb auch nach 5 Passagen undifferenziert, aber die Zellen mit 1 uM SC1 erfahrenen Zelltod nach dem vierten Durchgang behandelt. (Bild 2 von app beachten) Tabelle 1 fasst die morphologische Beobachtungen. 2. Expression der Pluripotenz Markers Maus ES-Zellen für 5 Passagen beibehalten wurden fixiert und untersucht durch Immunzytochemie für SSEA1, Oct4, Nanog und Sox2. Marker-Expression wurde ähnlich wie Zellen in LIF erhalten. (Abb. 3 und 4 des app beachten) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: Morphologie Vergleich von Zellen in LIF oder SC1 gepflegt. Kein Unterschied in der Morphologie beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="Abbildung 2 und 3" /> Abbildung 2 und Abbildung 3: Nanog, SSEA1, Sox2 und Oct4 Färbung von ES-Zellen mit SC1 oder LIF (Abb. 4 von ca. beachten) gepflegt. Cells in SC1 gepflegt zeigen ähnliche Pluripotenz-Marker zum Ausdruck Zellen in LIF erhalten. Tabelle 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Negative Control </td><td> LIF Positive Control </td><td> SC1 1um </td><td> SC1 300 nM </td><td> SC1 100 nM </td></tr><tr><td> 1. Besuch </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 2. Passage </td><td> Einige differenzierte Morphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 3. Passage </td><td> Mehrzahl der Zellen differenziert </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 4. Passage </td><td> Kein ESC Kolonien </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Der Zelltod beobachtet </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr><tr><td> 5th Passage </td><td> differenziert </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Der Zelltod beobachtet </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td><td> Normale ES Zellmorphologie </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

The authors of this article are employed by Stemgent that produces reagents and instruments used in this article.

Das kleine Molekül SC1 kann zur Selbst-Erneuerung mit einem undifferenzierten Zustand in Maus-ES-Zellen zu erhalten. Vor dem Einsatz auf einer ungeprüften Zelllinie, jedoch sollte es titriert auf die optimale Konzentration zu bestimmen. Zum Beispiel, testeten wir drei Konzentrationen auf der Maus-ES-Zelllinie ESC R1. 100 nM und 300 nM Konzentrationen konnten Maus-ES-Zellen zu erhalten, war jedoch ein 1 pM Konzentration giftig. SC1 kann auch unter Feeder-freien Bedingungen verwendet werden.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

Maus embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind konventionell mit Leukämie Inhibitory Factor (LIF), um sich selbst zu erneuern pflegen kultiviert.<sup&gt; 1</sup&gt; Allerdings ist LIF teuer und Aktivierung der LIF/JAK/STAT3 Weg ist nicht unbedingt erforderlich, um die Selbst-Erneuerung Zustand zu halten.<sup&gt; 2</sup&gt; Die SC1 kleine Molekül kann eine kostengünstige Alternative zu LIF werden. SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Illustration seines Wirkmechanismus macht ihn zu einem nützlichen Werkzeug, um die grundlegenden molekularen Mechanismen der Selbst-Erneuerung zu studieren. Hier zeigen wir das Verfahren zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen in Anwesenheit von SC1 und zeigen, dass sie in der Lage, sich selbst zu erneuern in der Abwesenheit von LIF zu halten sind. Zellen, die mit SC1 kultivierten zeigten ähnliche Morphologie im Vergleich zu Zellen mit LIF erhalten. Beide zeigten typische Maus-ES-Morphologie nach fünf Durchgängen. Expression von typischen Pluripotenz-Marker (Oct4, Sox2, Nanog und SSEA1) wurde nach fünf Durchgängen in Gegenwart von SC1 beobachtet. Darüber hinaus verursacht SC1 keine offenkundige Toxizität bei Maus-ES-Zellen.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 Funktionen durch duale Hemmung des Ras-GAP und ERK1. Wir testeten die Funktion von SC1 in Unterstützung von Maus ES-Zell-Selbst-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF und zeigte, dass SC1 in der Lage, sich selbst zu erneuern von Maus-ES-Zellkulturen zu halten ist.

Die Verwendung von SC1 (Pluripotin) zu MESC Self-Erneuerung in der Abwesenheit von LIF-Support

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Forschung

Biologie

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Der Einsatz von Biofeedback in der klinischen Virtual Reality: Die INTREPID Projekt

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Reporter Assay auf Gene, die Maus embryonalen Stammzellen Wartungs-und Self-Study Erneuerung Regulate

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identifizierung von Schlüsselfaktoren Regelselbsterneuerung und Differenzierung in EML hämatopoetischen Vorläuferzellen durch RNA-Sequenzierungsanalyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; In der Niere

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Die Verwendung von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Whole-Orgel Imaging und Quantitative Tissue Histologie des Bio-Verteilung von fluoreszenzmarkierten Moleküle zu bestimmen

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...