Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר שנג דינג של המחקר סקריפס המכון וד&quot;ר Hongkui דנג של אוניברסיטת פקין עזרתם ואת הכיוון.

1. הכנת צלחות MEF מזין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני תאים ES culturing, אחד להפשיר בקבוקון של מוקרן E14.5 CF-1 תאים MEF מזין (ראה נוהל שלנו על איך להפשיר תאים ES). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט מזין תאים MEF בצפיפות של 10,000 תאים / גם בצלחת 12 באר. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. MEF תא התקשורת: DMEM בתוספת 10% ES-PBS, 1X גלוטמין ו 1X שאינם חיוניים חומצות אמינו. </li></ol> 2. תחזוקה של התחדשות עצמית של תאים עכבר ES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק בתאי גזע עובריים באמצעות טריפסין. זרעים התאים בצפיפות של 50,000 תאים / מזין היטב על לוחות מוכן בעבר MEF בתקשורת צמיחה (ממ נוק KSR בתוספת 15%, 4 מ&quot;מ L-גלוטמין, 0.1 mM שאינם חיוניים חומצות אמינו 1X BME) בתוספת sc1 בריכוז הרצוי (השתמשנו 100 ננומטר, 300 ננומטר, ו 1 מיקרומטר). אנחנו גם הוסיף לשלוט חיובי היטב כי היה להשלים עם 1000 μ / ml של LIF. דגירה התאים לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 ימים 3-4 בקטע זה. רענן התקשורת כל 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים 1:10-1:15 עם טריפסין לשמור על צפיפות דומה לזו של צפיפות זריעה הראשונית. לאחר 5 קטעים, התאים ניתן לבדוק ביטוי של סמנים pluripotency טיפוסי באמצעות immunocytochemistry. </li></ol> 3. בחינת Immunocytochemical של סמנים pluripotency <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 500 μl של מקבע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 500 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 250 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי (השתמשנו Nanog, Sox2, SSEA1 ו Oct4 על דילולים הבאים: 1:500, 1:2000, 1:500, 1:500 ו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 250 μl של נוגדנים משני למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, שמירה מן האור (השתמשנו חמור נגד עכבר מצומדות עם אלקסה פלואוריד ® 555 ב ו - 1:2000 חמור ארנבת אנטי מצומדות עם אלקסה פלואוריד ® 488 ב 1 : 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף DAPI (הריכוז הסופי 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לשטוף האחרון דגירה 5 דקות כדי להמחיש גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol> 4. נציג תוצאות: 1. מורפולוגיה התוצאות: עכבר לתאי גזע עובריים (ESC R1) היו גדולים על תאים MEF מזין בנוכחות או LIF או sc1 לקיים עצמית והתחדשות בכל מדינה מובחן. אחרי הקטע השני, בידול יכול להיבחן בתאים ללא LIF או sc1 (שליטה שלילי) ואחרי 5 קטעים בעצם לא נצפו מושבות מובחן. LIF (בקרה חיובית) מושבות טופלו נותרו במצב מובחן לאורך 5 קטעים התא. תאים שטופלו sc1 בריכוזים של 300 ננומטר או 100 ננומטר גם נשאר מובחן לאחר 5 קטעים, לעומת זאת, בתאים שטופלו 1 sc1 מוות מיקרומטר תא מנוסה לאחר המעבר הרביעי. (איור 2 של פתק App) טבלה 1 מסכמת את התצפיות מורפולוגיים. 2. הביטוי של סמנים pluripotency עכבר לתאי גזע עובריים לשמור על 5 קטעים היו קבועים נבדק על ידי immunocytochemistry עבור SSEA1, Oct4, Nanog ו Sox2. הביטוי מרקר היה דומה התאים נשמר LIF. (איור 3 ו -4 של פתק App) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: השוואה מורפולוגיה של תאים נשמר LIF או sc1. אין הבדל במורפולוגיה נצפתה. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="איור 2 ו -3" /> איור 2 ו איור 3: Nanog, SSEA1, Sox2, ו Oct4 מכתים של תאים ES נשמר עם sc1 או LIF (איור 4 לציין האפליקציה). תאים נשמר sc1 להראות סמן דומה ביטוי pluripotency לתאי נשמר LIF. טבלה 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> בקרה שלילית </td><td> LIF חיובית שליטה </td><td> Sc1 1uM </td><td> Sc1 300 nM </td><td> Sc1 100 ננומטר </td></tr><tr><td> 1 המעבר </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 2 המעבר </td><td> מורפולוגיה חלק מובחן </td><td> דואר רגילS מורפולוגיה תא </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 3 המעבר </td><td> רוב התאים הבדיל </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 4 המעבר </td><td> אין ESC המושבות </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> מוות של תאים שנצפו </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr><tr><td> 5 המעבר </td><td> הבדיל </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> מוות של תאים שנצפו </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td><td> ES רגיל תא מורפולוגיה </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי Stemgent המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.

Sc1 מולקולה קטנה ניתן להשתמש כדי לשמור על התחדשות עצמית עם מדינה שלא עברו התמיינות בתאי עכבר ES. לפני השימוש בקו תא נבדק, לעומת זאת, זה צריך להיות טיטרציה כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי. לדוגמה, בדקנו בשלושה ריכוזים על ES העכבר התא קו ESC R1. 100 ננומטר 300 ריכוזים nM היו מסוגלים לקיים ES תאים העכבר, לעומת זאת, ריכוז 1 מיקרומטר היה רעיל. Sc1 יכול לשמש גם תחת מזין ללא תנאים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

עכבר גזע עובריים (ES) התאים בתרבית כמקובל עם פקטור מעכבות לוקמיה (LIF) כדי לשמור על התחדשות עצמית.<sup&gt; 1</sup&gt; עם זאת, LIF יקר הפעלה של מסלול LIF/JAK/STAT3 אינו נדרש לחלוטין כדי לשמור על המדינה עצמית והתחדשות.<sup&gt; 2</sup&gt; Sc1 מולקולה קטנה יכולה להיות חלופה חסכונית LIF. Sc1 פונקציות על ידי עיכוב כפול של ראס-GAP ו ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; איור של מנגנון הפעולה שלה עושה את זה כלי שימושי ללמוד את המנגנון המולקולרי היסוד של התחדשות עצמית. כאן אנו מדגימים את הליך עכבר לתאי גזע עובריים culturing בנוכחות sc1 ולהראות שהם מסוגלים לשמור על התחדשות עצמית בהעדר LIF. תאים בתרבית עם sc1 הראו מורפולוגיה דומה בהשוואה לתאי שמר עם LIF. שניהם הציגו מורפולוגיה טיפוסית ES העכבר לאחר חמישה קטעים. הביטוי של סמנים pluripotency טיפוסי (Oct4, Sox2, Nanog, ו SSEA1) נצפתה לאחר חמישה קטעים בנוכחות sc1. יתר על כן, לא נגרם sc1 רעילות גלויה על תאים עובריים בעכבר.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Sc1 פונקציות על ידי עיכוב כפול של ראס-GAP ו ERK1. בדקנו את תפקוד sc1 בתמיכה ES העכבר תא עצמית חידוש בהעדר LIF והראה כי sc1 הוא מסוגל לשמור על התחדשות עצמית של ES תרבויות עכבר התא.

השימוש sc1 (Pluripotin) לתמיכה המסקלין עצמית חידוש בהעדר LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

השימוש ביופידבק במציאות מדומה קליני: פרויקט ללא חת

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

שימוש באנזימתי Biosensors לכמת אנדוגני ATP או H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; בכליות

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

השימוש של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...