Name: the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif
Uploaded: 2009-11-18T17:30:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Шэн Дин из исследовательского института Скриппса и доктор Дэн Hongkui Пекинского университета за оказанную помощь и руководство.

1. Подготовка пластин MEF подачи <ol><li> За день до культивирования клетки ES, оттепель один флакон облученных E14.5 CF-1 MEF фидерных клеток (см. нашу процедуру о том, как оттепель ЭС клетки). </li><li> Пластина питателя MEF клетки при плотности 10000 клеток / лунку в 12-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. MEF ячейки СМИ: DMEM с добавлением 10% ES-би-эс, 1X 1X глютамин и не-незаменимых аминокислот. </li></ol> 2. Поддержание самообновления ЭС клетках мыши <ol><li> Отсоедините ES клеток с использованием трипсина. Семенной клетки при плотности 50000 клеток / лунку на заранее подготовленные MEF подачи пластин в питательной среде (Knockout MEM дополнена с 15% КСР, 4 мМ L-глутамина, 0,1 ммоль без незаменимых аминокислот и 1X BME) с добавлением SC1 при требуемой концентрации (мы использовали 100 нм, 300 нм, и 1 мкМ). Мы также добавили положительный контрольный колодец, который был дополнен 1000 μ / мл LIF. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. </li><li> Культуры клеток при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 3-4 дней в каждом проходе. Обновить СМИ каждые 48 часов. </li><li> Прохождение клетки 1:10 до 1:15 трипсином для поддержания одинаковой плотности, как начальная плотность посева. Через 5 пассажей, клетки могут быть проверены на предмет выражения типичных плюрипотентности маркеры, используя иммуноцитохимия. </li></ol> 3. Иммуноцитохимическая Экспертиза плюрипотентности Маркеры <ol><li> Вымойте клетки мягко три раза PBS. </li><li> Fix клеток с 500 мкл фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре. </li><li> Вымойте клетки мягко три раза PBS. </li><li> Блок неспецифического связывания с 500 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре. </li><li> Инкубируйте клетки с 250 мкл конкретных первичных антител (мы использовали Nanog, Sox2, SSEA1 и Oct4 на следующие разведения: 1:500, 1:2000, 1:500 и 1:500) </li><li> Вымойте клетки мягко три раза PBS. </li><li> Инкубируйте клетки с 250 мкл вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали осла антимышиным сопряженных с Alexa Fluor 555 ® на 1:2000 и осла анти-кролик сопряженных с Alexa Fluor ® 488 на 1 : 2000). </li><li> Вымойте клетки мягко три раза PBS. </li><li> Добавить DAPI (конечная концентрация 1 мкг / мл) до последнего мыть и инкубировать 5 минут для визуализации ядер. </li><li> Анализ клеток под флуоресцентным микроскопом. </li></ol> 4. Представитель Результаты: 1. Морфология результаты: ЭС клетки мыши (ESC R1) были выращены на MEF фидерных клеток в присутствии либо LIF или SC1 для поддержания самообновления в недифференцированное состояние. После второго прохода, дифференциации можно было наблюдать в клетках, не LIF или SC1 (отрицательный контроль) и после 5 проходов по сути, не недифференцированное колоний не наблюдалось. LIF (положительный контроль) рассматриваются колоний остались в недифференцированном состоянии на протяжении 5 проходов клетки. Клетки обрабатывали SC1 в концентрации 300 нМ или 100 нм также остается недифференцированной после 5 проходов, однако, клетки обрабатывали 1 мкМ SC1 опытных гибель клеток после четвертого прохода. (Рис 2 отметить приложение) В таблице 1 приведены морфологические наблюдения. 2. Экспрессия маркеров плюрипотентности ЭС клетки мыши поддерживается в течение 5 проходы были зафиксированы и рассмотрены иммуноцитохимии для SSEA1, Oct4, Nanog и Sox2. Маркер выражении был похож на клетки сохраняются в LIF. (Рис. 3 и 4 записки приложение) <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2a.jpg" alt="Рисунок 1" /> Рисунок 1: Морфология сравнению клеток поддерживается в LIF или SC1. Никаких различий в морфологии не наблюдалось. <img src="/files/ftp_upload/1550/1550fig2c.jpg" alt="На рисунке 2 и 3" /> Рисунок 2 и Рисунок 3: Nanog, SSEA1, Sox2, и Oct4 окрашивания ЭС клеток поддерживается с SC1 или LIF (рис. 4 записки приложение). Клетки поддерживается в SC1 показывают, что аналогичные выражения плюрипотентности маркер для клеток поддерживается в LIF. Таблица 1 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Отрицательный контроль </td><td> LIF Положительный контроль </td><td> SC1 1 мкм </td><td> SC1 300 нМ </td><td> SC1 100 нМ </td></tr><tr><td> Прохождение первого </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td></tr><tr><td> Второй проход </td><td> Некоторые дифференцированной морфологии </td><td> Нормальная ES морфологии клеток </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td></tr><tr><td> Третий Прохождение </td><td> Большинство клеток дифференцированных </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td></tr><tr><td> Четвёртое Прохождение </td><td> Нет ESC колонии </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Гибель клеток наблюдается </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td></tr><tr><td> Прохождение пятой </td><td> дифференцированный </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Гибель клеток наблюдается </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td><td> Нормальная морфология ячейки ES </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells.">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li><li>Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal.">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453, 519-523 (2008).</li><li>Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic+stem+cells+by+a+small+molecule.">Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule.</a> Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).</li></ol>

Авторы этой статьи являются сотрудниками Stemgent, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.

Небольшой SC1 молекулы могут быть использованы для поддержания самообновления с недифференцированное состояние, в ЭС клетках мыши. Перед использованием на непроверенных клеточной линии, однако, следует титровать, чтобы определить оптимальную концентрацию. Например, мы протестировали три концентрации на мыши ES клеточной линии ЭСК R1. 100 нм и 300 нм концентрации были в состоянии поддерживать ЭС клетках мыши, однако, 1 мкМ концентрации токсичных. SC1 также может быть использован под фидерных свободных условиях.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>SC1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stemgent</td>
<td>04-0011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LIF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>ESG1107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SSEA-1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>21702</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nanog antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abcam</td>
<td>ab21603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sox2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>Ab5603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oct4 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz</td>
<td>SC-5279</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of sc1 (pluripotin) to support mesc self-renewal in the absence of lif

Мышь эмбриональных стволовых (ЭС) клеток условно культивировали с подавления лейкоза фактор (LIF) для поддержания самообновления.<sup&gt; 1</sup&gt; Тем не менее, LIF является дорогостоящим и активации LIF/JAK/STAT3 путь не является абсолютно необходимая для поддержания самообновления государства.<sup&gt; 2</sup&gt; SC1 маленькая молекула может быть экономичной альтернативой LIF. SC1 функции через двойное торможение Рас-GAP и ERK1.<sup&gt; 3</sup&gt; Иллюстрация механизм его действия делает его полезным инструментом для изучения фундаментальных молекулярный механизм самообновления. Здесь мы показываем, процедуры для культивирования ЭС клетках мыши в присутствии SC1 и показать, что они способны поддерживать самообновление в отсутствие LIF. Клетки культивировали с SC1 показали сходные морфологии по сравнению с клетками поддерживается с LIF. Оба выставлены типичные морфологии ES мыши через пять проходов. Выражение типичных плюрипотентности маркеров (Oct4, Sox2, Nanog и SSEA1) наблюдалось после пяти мест в присутствии SC1. Кроме того, SC1 не вызвало открытой токсичности на ЭС клетках мыши.

Watch this Scientific Journal Video about The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF at JoVE.com

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 функции через двойное торможение Рас-GAP и ERK1. Мы протестировали функции SC1 в поддержке ЭСК мыши самообновление в отсутствие LIF и показал, что SC1 способен поддерживать самообновление мыши культур ЭСК.

Использование SC1 (Pluripotin) для поддержки мЭСК Самообновление в отсутствие LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Research

JoVE Journal

Biology

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

Использование протеазы Флуоресцентный Kit обнаружения для определения протеазы активность

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

The use of Biofeedback in Clinical Virtual Reality: The INTREPID Project

Использование биологической обратной связи в клинической Виртуальная реальность: Проект INTREPID

Generalized anxiety disorder (GAD) is a psychiatric disorder characterized by a constant and unspecific anxiety that interferes with daily-life ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Количественная оценка γH2AX Очаги в ответ на ионизирующего излучения

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Oct4GiP Reporter Анализ по изучению генов, которые регулируют мышиных эмбриональных стволовых клеток обслуживания и Самообновление

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Использование Хемостаты в Микробная системной биологии

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Определение ключевых факторов, регулирующих самообновлению и дифференцировке в EML гемопоэтических клеток-предшественников по РНК секвенирования анализа

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Использование ферментативного биосенсоров для Количественно эндогенного АТФ или H<sub&gt; 2</sub&gt; О<sub&gt; 2</sub&gt; В почках

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Разработка Вставка совместного культивирования системы двух клеточных типов в отсутствие межклеточных контактов

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Использование<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Обработки изображений цельнозерновой органов и тканей Количественные гистологии, чтобы определить, био-распределение флуоресцентно меченых молекул

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...